学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

产气荚膜梭菌plc和NetB基因的表达及单克隆抗体制备与鉴定

作　者: 郑晓星
导　师: 李广兴
学　校: 东北农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 产气荚膜梭菌 plc基因 NetB基因 原核表达 单克隆抗体
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 55次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens, C. perfringens)是一种重要的人兽共患病病原体,广泛分布于自然界,导致多种动物发生坏死性肠炎、肠毒血症,以及人类的气性坏疽和食物中毒。产气荚膜梭菌分泌的多种毒素在其引发的疾病中具有重要作用。本实验对所有产气荚膜梭菌均能分泌的α毒素与另一种新型毒素NetB毒素进行原核表达,通过PCR方法分别扩增编码α毒素去除信号肽后的plc基因片段和去除信号肽的NetB基因片段,利用原核表达载体pGEX-6P-1构建重组质粒pGEX-plc和pGEX-NetB,经双酶切鉴定和序列测定后转化至大肠杆菌BL211(DE3)感受态细胞,进行IPTG诱导表达。经SDS-PAGE分析,当1.0mmol/L IPTG诱导5h时重组蛋白表达量最高,并且主要以包涵体的形式存在,两个重组蛋白的相对分子质量分别为66kDa和62kDa。表达产物经切胶纯化后作为免疫原制备单克隆抗体。将纯化蛋白pGEX-plc和pGEX-NetB免疫BALB/c小鼠,加强免疫3d后取免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,对杂交瘤细胞进行筛选和亚克隆后获得9株分泌抗plc单克隆抗体的杂交瘤细胞(分别命名为H8C11、F4D9、F4C3、H11H12、F4G12、H8F8、 A10H9、A10E5和G7H8)和5株分泌抗NetB单克隆抗体的杂交瘤细胞(分别命名为D6H8、 F9G3、E7G2、E11C11和E7B11)。经Ig亚类鉴定试剂盒检测,表明A10E5和A10H9属于IgG2a, D6H8属于IgG2b,其余均属于IgG1。Western blot结果表明所有单克隆抗体均与相应的融合蛋白反应并出现特异性条带,其中A10H9和A10E5能够识别产气荚膜梭菌分泌的a毒素。制备的H8C11、F4D9、F4C3、D6H8、F9G3和E7G2腹水经辛酸-饱和硫酸铵法纯化后可见清晰的IgG的重链和轻链,分子量大小分别约为58kDa和26kDa。经间接ELISA方法检测,腹水中单克隆抗体的效价明显高于杂交瘤细胞上清,并且体外传代10次以上的杂交瘤细胞仍具有稳定分泌单克隆抗体的能力。抗α毒素杂交瘤细胞染色体的平均数量为91.1条,抗NetB毒素杂交瘤细胞染色体的平均数量为88.2条,均多于SP2/0细胞的56条染色体。免疫荧光试验证明,7株抗plc单克隆抗体(除G7H8和H11H12以外)能够结合产气荚膜梭菌的菌体表面。中和试验证明本实验制备的所有抗plc单克隆抗体都具有a毒素中和活性。

全文目录


摘要  8-9
Abstract  9-11
1 引言  11-19
  1.1 产气荚膜梭菌的主要毒素  11-12
  1.2 产气荚膜梭菌毒素的作用方式  12-14
    1.2.1 具有损伤细胞膜作用的毒素  12-13
    1.2.2 具有形成微孔作用的毒素  13
    1.2.3 以不明方式作用于细胞膜的毒素  13
    1.2.4 具有细胞内活性的毒素  13-14
    1.2.5 水解酶  14
  1.3 坏死性肠炎  14-16
    1.3.1 NE临床症状与病理变化  14-15
    1.3.2 α毒素与NE  15
    1.3.3 NetB毒素与NE  15-16
    1.3.4 NE疫苗的研究进展  16
  1.4 单克隆抗体技术  16-17
  1.5 本研究的目的与意义  17-19
2 材料与方法  19-38
  2.1 实验材料  19-23
    2.1.1 实验动物及细胞  19
    2.1.2 菌株和质粒  19
    2.1.3 培养基和分子生物学试剂  19
    2.1.4 主要试剂的配制  19-22
    2.1.5 仪器设备  22-23
  2.2 实验方法  23-38
    2.2.1 目的基因重组质粒的构建  23-27
    2.2.2 重组质粒的鉴定  27-28
    2.2.3 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达  28-30
    2.2.4 单克隆抗体的制备  30-34
    2.2.5 单克隆抗体的生物学活性鉴定  34-37
    2.2.6 数据统计  37-38
3 结果  38-51
  3.1 PCR扩增plc基因与NetB基因  38
  3.2 重组质粒的鉴定  38-41
    3.2.1 重组质粒的PCR鉴定与双酶切鉴定  38-40
    3.2.2 重组质粒的序列鉴定  40-41
  3.3 重组蛋白的诱导表达  41-42
  3.4 单克隆抗体的制备  42-44
    3.4.1 间接ELISA检测方法的建立  42
    3.4.2 细胞融合  42-43
    3.4.3 阳性杂交瘤细胞的筛选与建立  43
    3.4.4 腹水的制备与纯化  43-44
  3.5 单克隆抗体的生物学活性鉴定  44-51
    3.5.1 单克隆抗体效价与浓度的测定  44-45
    3.5.2 单克隆抗体的Western blot鉴定  45-46
    3.5.3 间接ELISA检测分泌单克隆抗体稳定性  46-47
    3.5.4 杂交瘤细胞的染色体计数  47
    3.5.5 小鼠单克隆抗体Ig亚类鉴定  47
    3.5.6 免疫荧光试验  47
    3.5.7 体外中和试验  47-51
4 讨论  51-55
  4.1 重组质粒的构建及诱导表达  51
  4.2 杂交瘤细胞的融合及筛选  51-52
  4.3 杂交瘤细胞的扩大培养  52-53
  4.4 腹水的制备及纯化  53
  4.5 单克隆抗体生物学特性的鉴定  53-55
5 结论  55-56
致谢  56-57
参考文献  57-65
攻读硕士学位期间发表的学术论文  65

相似论文

  1. 拟南芥胱硫醚-γ-合成酶（D-AtCGS）基因在大肠杆菌中的表达及抗血清制备,Q943.2
  2. 南极冰藻GPx、GST和SAHH基因的克隆、定量分析及原核表达载体的构建,Q943.2
  3. 抗吡虫啉—甲基对硫磷双特异性单克隆抗体的研究,S482.2
  4. 草鱼呼肠孤病毒vp5、vp7基因cDNA的克隆、表达及VP5、VP7蛋白亚细胞定位研究,S941.41
  5. 草鱼呼肠孤病毒vp6和ns38基因的克隆、表达及VP6和NS38免疫原性研究,S941.41
  6. 甲型流感病毒M2蛋白的表达、纯化及其免疫原性的研究,R392
  7. 小麦黄花叶病毒（WYMV）RNA2编码基因的功能研究,S435.121
  8. 红笛鲷清道夫受体B型Ⅰ类和抗冻蛋白Ⅱ型基因的克隆、表达与定量分析,S917.4
  9. 羊种布鲁氏菌16M优势蛋白抗原的鉴定,S852.61
  10. STLV-1病毒间接ELISA方法建立及杂交瘤细胞株的筛选,R373
  11. 鸭源鸡杆菌抗体消长规律研究及抗脂多糖单抗杂交瘤细胞株的建立,S858.32
  12. 稳定分泌抗羊种布鲁菌脂多糖单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立,R392
  13. 传染性法氏囊病病毒VP2基因的表达与单克隆抗体的制备,S852.65
  14. 猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与鉴定,S852.65
  15. 鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1、N基因的序列分析,S852.65
  16. 猪细小病毒河南流行株的分离、鉴定及部分生物学特性研究,S852.65
  17. 人源β-防御素-6的原核表达及纯化,Q78
  18. 圆眼珍珠蛙（Lepidobatrachus laevis）皮肤cDNA文库的构建、筛选及胰蛋白酶抑制剂的原核表达和活性研究,Q78
  19. 新型菊酯类农药降解酶的生化鉴定及分子改造研究,X172
  20. 棉铃虫与烟夜蛾寄主选择机制的比较研究,S435.622.3
  21. 猪TNF-α单克隆抗体制备与PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞TNF-α变化规律研究,S858.28

中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 病原细菌
© 2012 www.xueweilunwen.com