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猪链球菌2型MRP和sspA抗原表位预测与表达及其免疫特性

作　者: 吴立志
导　师: 伍晓雄; 沈志强
学　校: 华中农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 猪链球菌2型 溶菌酶释放蛋白 枯草杆菌素样蛋白酶 B细胞表位 原核表达 免疫保护
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


本研究的目的在于获得可抵御强毒猪链球菌2型(streptococcus suis type2,SS2)感染的保护性抗原肽,并分析其免疫特性,以期为研制低毒、高效的SS2蛋白亚单位疫苗提供科学依据。选取具有保护性或者具有重要免疫作用的蛋白——溶菌酶释放蛋白(muramidase-released protein,MRP)和枯草杆菌素样蛋白酶(subtilisin-like serine protease,sspA)。参考NCBI蛋白质数据库中MRP、sspA氨基酸序列和结构信息,避开蛋白的毒力结构域、舍弃信号肽段、去除膜锚定结构域和处于膜内(胞浆)的肽段。运用蛋白分析软件ANTHEPROT5.0对蛋白的二级结构(螺旋、折叠、转角、无规卷曲)和B细胞表位进行综合预测与分析(亲水性、疏水性、抗原性、跨膜结构、溶剂可及性等),确定蛋白的B细胞优势表位簇。使用Oligo6.0和Primer5.0设计出两端带合适酶切位点的引物并通过PCR获得预测的抗原肽段基因,酶切连接插入原核表达载体pET32a,导入表达菌株BL21表达菌株,构建重组抗原的原核表达系统。IPTG诱导表达,以渗透性休克法和热休克法纯化重组蛋白；使用灭活SS2免疫血清Western blot检测重组蛋白的免疫原性及其与SS2免疫血清的反应性。纯化的重组蛋白免疫雌性SPF CD1小鼠检测其安全性,用强毒SS2SDLVDU株攻毒重组蛋白免疫小鼠,评估重组蛋白的免疫保护效力。预测结果显示MRP的950～1210aa肽段、sspA的91～323aa肽段为B细胞优势表位簇。构建了上述肽段基因与pET32a的原核重组表达系统,重组蛋白可溶性表达,微量蛋白测定仪测定表达量为10mg/mL; Western blot显示重组蛋白具有良好的免疫原性和反应性；免疫安全性试验表明,MRP和sspA重组蛋白均安全可靠；免疫效力试验表明,MRP的950-1210aa肽段重组蛋白对小鼠的免疫保护率为40%,为菌体免疫所提供保护率的50%；sspA的91～323aa肽段重组蛋白虽然对小鼠不产生保护力,但是可以延缓小鼠的死亡时间,与MRP的950-1210aa肽段重组蛋白共同免疫的保护率为60%,表现了协同保护作用。

全文目录


摘要  8-9
Abstract  9-10
缩略词表  10-11
第1章 文献综述  11-24
  1.1 猪链球菌病概述  11-13
    1.1.1 病原及流行病学  11-12
      1.1.1.1 病原  11
      1.1.1.2 自然感染及传播途径  11-12
      1.1.1.3 易感动物  12
    1.1.2 临床症状和病理变化  12-13
      1.1.2.1 临床症状  12
      1.1.2.2 病理变化  12-13
  1.2 猪链球菌血清型2型毒力因子的研究进展  13-19
    1.2.1 已阐明的毒力因子  13-15
      1.2.1.1 荚膜多糖  13
      1.2.1.2 溶菌酶释放蛋白和胞外因子  13-14
      1.2.1.3 溶血素  14
      1.2.1.4 纤连蛋白结合蛋白  14
      1.2.1.5 谷氨酸脱氢酶  14-15
    1.2.2 新鉴定的毒力元件  15-18
      1.2.2.1 Sao蛋白  15
      1.2.2.2 存在于89K毒力岛的双信号转导系统  15
      1.2.2.3 dltA基因  15-16
      1.2.2.4 pgdA基因  16
      1.2.2.5 srtA基因  16
      1.2.2.6 Ⅳ型工肽基肽酶  16-17
      1.2.2.7 毒力调控子R  17
      1.2.2.8 烯醇酶  17
      1.2.2.9 次黄嘌呤单磷酸脱氢酶  17-18
      1.2.2.10 谷氨酰胺合成酶  18
    1.2.3 毒力因子研究小结  18-19
  1.3 B细胞表位预测的原则和方法  19-22
    1.3.1 蛋白质抗原的表位  19-20
      1.3.1.1 表位的概念  19
      1.3.1.2 表位的分类  19-20
    1.3.2 细胞表位的预测与筛选  20-22
      1.3.2.1 线性B细胞抗原表位的预测  20-21
      1.3.2.2 B细胞表位的实验检验  21-22
  1.4 研究目的与意义  22-24
第2章 材料与方法  24-39
  2.1 实验材料  24-28
    2.1.1 菌株  24
    2.1.2 载体  24-25
    2.1.3 工具酶及主要试剂  25
    2.1.4 主要缓冲液与相关试剂的配制  25-27
      3.1.4.1 培养基及抗生素  25-26
      2.1.4.2 琼脂糖凝胶电泳试剂及缓冲液  26
      2.1.4.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液及试剂  26-27
      2.1.4.4 Western Blot缓冲液及试剂  27
      2.1.4.5 ELISA缓冲液及试剂  27
      2.1.4.6 其他试剂  27
    2.1.5 生物信息学软件  27-28
  2.2 试验方法  28-39
    2.2.1 SS2SDLVDU株的培养与PCR鉴定  28-29
      2.2.1.1 SS2SDLVDU株的培养  28
      2.2.1.2 基因组提取  28
      2.2.1.3 PCR鉴定  28-29
      2.2.1.4 菌种保存  29
    2.2.2 SS2SDLVDU株对CDl小鼠毒力测定  29-31
      2.2.2.1 毒力基因表型鉴定  29-30
      2.2.2.2 最小100%致死剂量与最大0%致死剂量测定  30
      2.2.2.3 LD50的测定  30-31
    2.2.3 MRP、sspA抗原肽段选取  31
      2.2.3.1 MRP抗原肽段选取  31
      2.2.3.2 sspA氨基酸序列分析  31
    2.2.4 优势表位簇抗原重组表达系统的构建  31-34
      2.2.4.1 SS2培养与基因组提取  31
      2.2.4.2 PCR引物设计及抗原肽基因扩增  31-32
      2.2.4.3 pET32a载体质粒的获取  32
      2.2.4.4 扩增产物和载体质粒的酶切与连接  32-33
      2.2.4.5 重组表达载体的转化与鉴定  33-34
      2.2.4.6 重组克隆与表达菌株的保存  34
    2.2.5 重组抗原的获取与鉴定  34-35
      2.2.5.1 重组抗原的诱导表达  34
      2.2.5.2 重组抗原的纯化  34-35
      2.2.5.3 Western Blot检测  35
    2.2.6 灭活SS2 CD1小鼠免疫血清制备  35-36
    2.2.7 重组抗原CD1小鼠免疫血清制备  36
    2.2.8 重组抗原CDl小鼠免疫血清抗体水平检测ELISA方法的建立  36-37
      2.2.8.1 包被原制备  36
      2.2.8.2 方阵滴定  36-37
    2.2.9 CD1小鼠免疫安全性试验与免疫效力试验及抗体水平监测  37-39
      2.2.9.1 免疫原制备  37
      2.2.9.2 免疫安全性试验  37
      2.2.9.3 免疫效力试验  37-38
      2.2.9.4 抗体水平监测  38-39
第3章 结果与分析  39-51
  3.1 SS2SDLVDU的培养与PCR鉴定  39-40
  3.2 SS2SDLVDU株毒力测定  40-42
    3.2.1 毒力表型鉴定  40-41
    3.2.2 Dm、Dn值测定  41
    3.2.3 LD50测定  41-42
  3.3 MRP、sspA抗原肽选取  42-44
    3.3.1 MRP抗原肽选取  42-43
    3.3.2 sspA抗原肽选取  43-44
  3.4 重组抗原表达系统构建  44-46
    3.4.1 重组抗原肽基因的PCR扩增  44-45
    3.4.2 重组表达载体pET32a-mrp-1与pET32a-prtS-1酶切鉴定  45-46
  3.5 重组抗原的诱导表达与纯化  46-47
    3.5.1 重组蛋白诱导表达与SDS-PAGE  46
    3.5.2 重组蛋白的纯化  46-47
  3.6 重组抗原Western Blot鉴定  47-48
  3.7 抗原包被浓度和血清稀释度的确定  48-49
  3.8 小鼠免疫安全性试验与抗体水平监测及免疫效力试验  49-51
    3.8.1 小鼠免疫安全性试验  49
    3.8.2 抗体水平监测  49
    3.8.3 小鼠免疫效力试验  49-51
第4章 讨论与结论  51-53
  4.1 讨论  51-52
    4.1.1 B细胞抗原表位的预测与验证  51
    4.1.2 MRP-1、sspA-1蛋白的表达及纯化技术  51
    4.1.3 免疫效力试验分析  51-52
  4.2 结论  52-53
展望  53-54
参考文献  54-63
致谢  63-64
硕士期间发表文章情况  64

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 病原细菌
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