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脐带间充质干细胞移植前细胞活性评价指标的研究

作　者: 雷鑫
导　师: 牛勃
学　校: 山西医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 间充质干细胞 细胞移植 细胞活性 克隆形成率
分类号: R329.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


背景：人脐带来源间充质干细胞（human umbilical cord derived mesenchymal stemcells, hUC-MSCs）凭借其组织来源广泛、含量丰富、不受伦理限制等优势成为间充质干细胞的理想来源,是目前干细胞移植的热点。UC-MSCs作为一种动态的活细胞，移植前细胞活性对治疗效果的影响最为直接。目前移植前细胞活性检测指标通常采用经典台盼蓝染色法。但是由于易受主观因素的影响，并且其检测针对的是细胞膜完整性，仅仅是细胞生理状态的一部分，并不能时时地准确反映细胞整体功能，从而影响对临床应用的指导意义。因此，探寻一种可准确反映细胞功能状态的活性指标，将会大大促进间充质干细胞在临床疾病治疗、科学研究方面的发展。目的：通过对多种具有代表性的细胞活性测定方法进行比较，探寻可准确反映细胞功能状态的活性指标，筛选出一定条件下能够真实反映移植前细胞状态的活性指标，为UC-MSCs临床应用提供指导。方法：1.体外分离培养人脐带间充质干细胞，细胞免疫学表型鉴定，成骨成脂诱导；2.UC-MSCs的保存：0.9%氯化钠注射液，4℃条件下保存0h、2h、4h、6h；3.评估人工活性测定方法（台盼蓝法、TUNEL、Live-Dead Assay、贴壁实验）的准确性；4.采用多种具有代表性的细胞活性测定方法（台盼蓝染色法、Annexin V-PI、TUNEL、CCK-8、Live-Dead Assay、贴壁实验）检测保存后细胞存活率；5.对细胞存活率与反应细胞功能状态指标CFE进行相关性分析；6.对贴壁实验在不同观察者之间的可靠性进行统计学分析。结果：1.针对0.9%生理盐水保存不同时间点（0h、2h、4h、6h）的UC-MSCs进行活性检测，人工检测方法（台盼蓝染色法、TUNEL、Live-Dead Assay、贴壁实验）之间最大测量差值大约分别是1.46%、6.89%、8.23%、8.94%，均小于10%的统计误差；2.在UC-MSCs保存0h时，台盼蓝染色法同其它几种经典活性测定方法（Annexin V-PI、TUNEL、CCK-8、Live-DeadAssay、贴壁实验）比较，结果相似，差异无统计学意义，而对于保存一定时间后UC-MSCs，细胞活力则具有显著性差异；3.观察保存后细胞存活率与反应其功能状态指标CFE之间的关联程度，采用台盼蓝染色法测得的活细胞比例与CFE的相关性为r2=0.893，而其它的检测方法（Annexin V-PI、TUNEL、CCK-8、Live-DeadAssay、贴壁实验）测得的活细胞比例与CFE则具有较好的的相关性（分别为r2=0.935、0.949、0.924、0.947、0.982），其中贴壁实验的相关系数最高；4.贴壁实验作为一种人工活性检测方法，其结果的可靠性存在争议。采用其进行活力分析时，5个观察者测得的活性数据不存在显著性差异，具有较好的一致性。结论：1.采用几种经典测定方法（台盼蓝染色法、Annexin V-PI、TUNEL、CCK-8、Live-Dead Assay、贴壁实验）检测细胞活力时，台盼蓝染色法适用于即刻细胞活力的检测；2.对于经过保存之后的细胞，台盼蓝法过高的估计了细胞功能，其他活性检测方法则可以较之相对精确，而其中贴壁实验则是目前众多检测细胞活性方法中相对较为精确的；3.观察者的差异性并不会影响贴壁实验结果的可靠性。

全文目录


中文摘要  6-9
Abstract  9-12
英文缩略词表  12-13
前言  13-15
第一章 材料与方法  15-30
  1.1 实验材料  15-22
    1.1.1 脐带来源  15
    1.1.2 主要实验试剂  15-16
    1.1.3 主要实验耗材  16-17
    1.1.4 主要仪器  17-18
    1.1.5 溶液配制  18-22
  1.2 实验方法  22-30
    1.2.1 脐带标本的采集  22
    1.2.2 UC-MSCs 的制备  22
    1.2.3 UC-MSCs 的原代、传代培养及细胞冻存  22-23
    1.2.4 细胞计数  23-24
    1.2.5 UC-MSCs 的鉴定  24-25
    1.2.6 UC-MSCs 的保存  25
    1.2.7 保存后 UC-MSCs 活性测定  25-29
    1.2.8 UC-MSCs 克隆形成能力的检测  29
    1.2.9 统计学分析  29-30
第二章 实验结果  30-43
  2.1 UC-MSCs 原代培养细胞生长情况及光镜下形态  30
  2.2 UC-MSCs 鉴定结果  30-34
  2.3 不同人工活性检测方法测定经保存 UC-MSCs 存活率  34
  2.4 不同检测方法对 UC-MSC 保存不同时间点测得的细胞活性比较  34-35
  2.5 不同检测方法对经保存 UC-MSCs 活性分析与集落形成率的比较  35-42
  2.6 评估贴壁实验的可靠性  42-43
第三章 讨论  43-47
参考文献  47-52
综述  52-70
  参考文献  59-70
发表文章  70-71
致谢  71-72
个人简介  72

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体形态学 > 人体组织学 > 人体细胞学
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