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瘦素调控大鼠肝纤维化的信号转导机制及保肝宁的干预作用

作　者: 贺松其
导　师: 吕志平
学　校: 第一军医大学
专　业: 中西医结合临床
关键词: 保肝宁肝纤维化瘦素瘦素受体信号转导
分类号: R575.2
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

科研工作来源:国家自然基金资助项目（30672769）;广东省中医药局资助项目（1050128）。研究背景:肝纤维化（hepatic fibrosis,HF）主要是由肝脏内细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的合成大于降解,致使ECM在肝脏内过度沉积所致。它是大多数慢性肝病所共有的病理特征,也是慢性肝炎、肝硬化等进一步发展、恶化的重要中间环节。据统计,我国患慢性乙型肝炎的病人超过3000万,每年死于肝炎后肝硬化者有40万人,而治愈肝硬化的唯一途径是阻断肝纤维化。迄今为止,全世界包括我国在内的国家尚没有批准一个抗纤维化西药,中医药抗肝纤维化的实验和临床研究已凸现其特有的优势,其中尤以复方中药抗肝纤维化的多靶点治疗作用更为引人注目。我们在全面认识慢性肝病肝纤维化病因病机的基础上,研制出抗肝纤维化新方保肝宁,它寓疏肝解郁、益气健脾;活血化瘀、软坚散结;兼清热利湿解毒等重要治法于一体,应用于临床,疗效卓著。在国家自然科学基金、广东省自然科学基金的资助下,我们开展了保肝宁抗肝纤维化的信号转导机制研究。保肝宁抑制HSC增殖作用可能与NF-κB信号转导通路有关,保肝宁能明显降低HSC细胞NF-κB的表达及IκB的磷酸化。瘦素（Leptin）是新发现的促肝纤维化的细胞因子,目前对瘦素促肝纤维化的分子机制研究,国外刚刚起步,国内相关文献报道更加少有。因此,我们认为系统的研究瘦素及其信号转导机制,并在此基础上探讨中药保肝宁对瘦素、瘦素受体及受体后介导的信号转导通路的影响,有助于进一步阐明其抗肝纤维化的作用途径和作用靶点,为保肝宁防治和逆转肝纤维化提供更加充分的理论依据,同时,对于深化和完善肝纤维化的机制研究具有十分重要的理论意义。目的和意义:探讨保肝宁抗肝纤维化的分子机制,为保肝宁应用于临床提供充分的理论依据,为开发抗肝纤维化新药保肝宁奠定坚实的理论基础。研究方法:以复合因素诱导的肝纤维化模型大鼠为研究对象,观察保肝宁（方药由黄芪、桃仁、丹参、黄芩、鳖甲等组成）对模型大鼠瘦素及其信号转导通路的影响。50只Wistar大鼠随机分为5组,即正常对照组（A组）、模型组（B组）、秋水仙碱组（C组）、保肝宁大剂量组（D组）、保肝宁中剂量组（E组）。除A组外,其余大鼠于实验第1d每只皮下注射40%（体积分数）CCl₄花生油0.5ml·100g^-1;以后每3日注射0.3ml·100g^-1。除A组外,各组均以普通饲料喂养,并以5%乙醇为饮料。A组注射等量花生油,进食普通饲料并自由饮水。各组从造模第2天开始,每日给相应药物灌胃,C组每日灌服秋水仙碱0.011mg·100g^-1,D、E组分别每日灌服保肝宁3.54g·100g^-1、1.77g·100g^-1,B组及A组灌以等量蒸馏水作对照。第6厨末,处死动物,取血和肝组织备用。取新鲜肝组织梯度置于-70℃中保存,用于蛋白印迹实验（Western blotting analysis）;一部分肝组织固定于10%中性福尔马林溶液,肝组织常规脱水,石蜡包埋,切片厚5μm,做光镜观察和免疫组化用;血清谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）活性;总胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）采用全自动生化分析仪检测;放免法测定血清瘦素（Leptin）水平;光学显微镜下观察肝组织病理学变化;免疫组织化学技术检测瘦素（Leptin）及瘦素受体（OB-Rb）等的表达水平;应用蛋白印迹试验（Western blotting analysis）检测瘦素受体（OB-Rb）,JAK2（Janus激酶,Januskinase）和转录活化因子（STAT3）蛋白的表达水平以及它们的磷酸化水平。统计学处理:计量资料用平均值±标准差（x±s）表示,数据处理采用SPSS14.0统计软件包进行单因素方差分析（one-way ANOVA）。研究内容和过程:1.观察保肝宁对模型大鼠的症状、体征及肝、脾指数的影响模型组大鼠精神不振、消瘦、厌食,饮水减少,大便稀溏,小便色黄而少;肝脏表面较正常组欠光滑,颜色浅,边缘钝,质地硬,部分标本表面凹凸不平,呈小结节状;脾脏明显肿大,呈暗红色。各药物组大鼠精神状态、毛色泽、饮食饮水、排便等一般情况均明显改善,以保肝宁各组改善情况为佳。在增加体重方面,与模型组比较,秋水仙碱、保肝宁大、中剂量均能显著增加大鼠体重（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01）;各药物组比较差异无显著性意义（p＞0.05）。各药物组大鼠肝脏表面较光滑,颜色较红;脾脏与正常组大鼠相比较无明显差异。与正常组比较,模型组、各药物组肝指数均明显增加,差异有非常显著性意义（P均＜0.01）,模型组脾脏指数亦明显升高,差异有非常显著性意义（P均＜0.01）;与模型组比较,各药物组均能显著降低模型大鼠肝、脾指数,差异有显著性意义（P均＜0.01）;其中,保肝宁大剂量组降低肝指数的作用明显优于秋水仙碱组,差异有显著性意义（p＜0.05）。2.观察保肝宁对肝纤维化大鼠肝组织形态学的影响光镜观察显示:模型组正常肝小叶结构破坏,肝索排列紊乱,可见肝细胞点状坏死,肝细胞空泡变性散在分布,间质增生明显,胶原纤维构成的纤维间隔形成,形成较多完整的假小叶。各药物组肝小叶样结构明显改善,胶原纤维间隔较少,肝细胞坏死、炎性细胞浸润少见,但极少数大鼠仍有不完全性假小叶。3.保肝宁对模型大鼠血清肝功能、血脂的影响与正常组比较,模型组血清ALT、AST、AST/ALT比值均明显升高（P均＜0.01）,各药物组ALT、AST水平亦明显升高（P均＜0.01）;与模型组比较,各药物组血清ALT、AST活性明显下降,差异有非常显著性意义（P均＜0.01）,保肝宁中剂量组AST/ALT比值也明显下降,差异有显著性意义（P＜0.05）;保肝宁大剂量组降低AST作用明显优于秋水仙碱（P＜0.05）。与正常组比较,模型组及各药物组血清TC、TG水平明显下降,差异有非常显著性意义（P＜0.01）;与模型组比较,保肝宁大、中剂量组血清TC、TG水平明显升高,差异有非常显著性意义（P均＜0.01）。其中,保肝宁大剂量升高TC作用明显明显优于秋水仙碱组（P＜0.05）,保肝宁大、中剂量组升高TG作用均明显优于秋水仙碱组（P均＜0.05）。4.保肝宁对模型大鼠血清瘦素（Leptin）水平的影响与正常组比较,模型组及各药物组血清Leptin水平明显升高,差异有非常显著性意义（P＜0.01）;与模型组比较,各药物组则明显下降（P＜0.01、P＜0.01、P＜0.05）;各药物组降低Leptin作用,差异无显著性意义（P＞0.05）。5.保肝宁对肝纤维化大鼠肝组织瘦素（Leptin）及瘦素受体（OB-Rb）的影响（1）Leptin的表达:正常组肝细胞内呈阴性或极弱阳性表达,偶见于汇管区、小叶中央静脉周围及肝索Disse腔间隙中。模型组肝内Leptin表达明显增强,数目增多,呈棕黄色胞质型分布;小叶中央静脉周围、汇管区及肝小叶内均有大量条索状、星芒状瘦素阳性表达,高倍镜下,阳性表达主要分布于HSC胞质中。各药物组阳性染色程度较模型组明显减轻,阳性细胞数目减少。统计学显示,与正常组比较,模型组、各药物组Leptin表达明显增多,差异有非常显著性意义（P＜0.01）;与模型组比较,各药物组均可以降低Leptin的表达,差异有显著性意义（p＜0.01）;各药物组两两比较差异无显著性意义（P＞0.05）。（2）OB-Rb表达:正常组肝细胞内呈阴性或极弱阳性表达,偶见于汇管区、小叶中央静脉周围及肝索Disse腔间隙中。模型组肝内表达明显增强,数目增多,呈棕黄色胞质型分布;高倍镜下,阳性表达主要分布于非实质细胞（包括肝星状细胞、窦内皮细胞、枯否细胞等）胞质及胞膜上,部分可定位于核。统计学显示,与正常组比较,模型组、各药物组OB-Rb表达明显增多,差异有显著性意义（P均＜0.01）;与模型组比较,各药物组OB-Rb表达均无明显变化,差异无显著性意义（P均＞0.05）;各药物组OB-Rb的表达两两比较差异无显著性意义（P＞0.05）。6.保肝宁对肝纤维化大鼠肝组织瘦素受体（OB-Rb）及其JAK2-STAT3信号转导通路的影响（1）OB-Rb、JAK2、STAT3蛋白表达。用Western Blot法检测肝脏组织细胞内OB—-b、JAK2、STAT3蛋白表达情况,正常组蛋白表达量最少,保肝宁和秋水仙碱处理组蛋白条带颜色均较浅,模型组条带颜色最深。与正常组比较,模型组、保肝宁大、中剂量组和秋水仙碱组OB-Rb、JAK2、STAT3蛋白程度均增高;与模型组相比,各药物组的OB-Rb、JAK2、STAT3蛋白表达显著降低;保肝宁大、中剂量组和秋水仙碱组相比,OB-Rb、JAK2、STAT3蛋白显著降低。（2）JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平。用Western Blot法检测肝脏组织细胞内JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平,正常组蛋白磷酸化水平最低,保肝宁和秋水仙碱处理组蛋白条带颜色均较浅,模型组条带颜色最深。与正常组比较,模型组、各药物组P-JAK2、P-STAT3蛋白表达水平均增高;与模型组相比,各药物组的P-JAK2、P-STAT3蛋白表达显著降低;保肝宁大、中剂量组和秋水仙碱组相比,P-JAK2、P-STAT3蛋白水平显著降低。结论:保肝宁能有效的阻止模型大鼠肝纤维化进程,其作用机制为:1.保肝宁可以有效的改善肝纤维化模型大鼠的一般情况:如改善模型大鼠的精神状况,增加体重,改善食欲和饮水等症状,提高大鼠生存质量;显著降低模型大鼠肝、脾指数。2.形态学观察表明保肝宁能明显改善破坏的肝小叶结构,减轻纤维组织增生;明显减少胶原纤维间隔、肝细胞坏死以及炎性细胞的浸润等。3.保肝宁明显降低纤维化模型大鼠血清ALT、AST含量,TG、TC水平明显升高,提示保肝宁能有效减轻炎症反应,调节血脂水平,保护肝细胞,从而抑制早期肝纤维化的启动。4.保肝宁明显降低纤维化模型大鼠血清Leptin水平,有效的阻止了Leptin与OB-Rb结合而发挥的诱导HSC活化和增殖作用。5.保肝宁明显抑制纤维化模型大鼠肝组织Leptin的表达,明显减轻Leptin阳性染色程度,减少阳性细胞数目,提示Leptin是保肝宁抗肝纤维化的作用靶点之一。6.保肝宁有效抑制纤维化模型大鼠肝组织OB-Rb以及其信号转导分子JAK2、STAT3的蛋白表达,显著降低JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平,提示保肝宁具有抑制OB-Rb及其信号转导作用,这可能是其抗肝纤维化的分子机制之一。综上所述,保肝宁具有综合抗肝纤维化的药理作用,其作用机制为多途径、多靶点。抑制Leptin的表达、抑制OB-Rb及其JAK2/STAT3信号转导通路,可能是其抗肝纤维化的分子机制之一。而这一机制与抑制炎症反应,调节血脂水平,保护肝细胞,减少细胞因子所产生的瀑布效应,从而抑制肝纤维化的启动密切相关。

全文目录

摘要  3-9
ABSTRACT  9-19
第一章文献研究  19-42
  第一节:中药抗肝纤维化作用机制研究  19-27
    一、保护肝细胞,抗肝损伤  19-21
    二、抑制ECM的合成  21-22
    三、促进ECM的降解  22-23
    四、调控基因表达水平  23
    五、复合性作用机制  23-27
  第二节:保肝宁抗肝纤维化的方证原理和作用机制  27-33
    一、对慢性肝炎肝纤维化病因病机的认识  27-28
    二、保肝宁抗肝纤维的方证原理  28-30
    三、保肝宁抗肝纤维的微观药效学和作用机制  30-33
  第三节:瘦素刺激肝星状细胞增殖的信号转导机制及中药干预  33-42
    一、瘦素是新发现的促HSC增殖的细胞因子  34-35
    二、瘦素刺激HSC增殖的信号转导机制  35-37
    三、NF-κ B信号通路可能参与瘦素对HSC的增殖调控  37
    四、保肝宁抑制HSC增殖的信号转导机制研究  37-42
第二章实验研究  42-80
  第一节:保肝宁对模型大鼠症状、体征及肝、脾指数的影响  42-48
    一、材料与方法  42-43
    二、结果  43-45
    三、讨论  45-48
  第二节保肝宁对肝纤维化大鼠肝组织形态学的影响  48-52
    一、材料与方法  48-49
    二、结果  49
    三、讨论  49-52
  第三节保肝宁对肝纤维化大鼠血清肝功能、血脂的影响  52-56
    一、材料与方法  52
    二、结果  52-53
    三、讨论  53-56
  第四节保肝宁对肝纤维化大鼠血清瘦素(Leptin)水平的影响  56-61
    一、材料与方法  56-57
    二、结果  57
    三、讨论  57-61
  第五节保肝宁对肝纤维化大鼠肝组织瘦素(Leptin)、瘦素受体(OB-Rb)的影响  61-68
    一、材料与方法  61-62
    二、结果  62-63
    三、讨论  63-68
  第六节保肝宁对肝纤维化大鼠肝组织瘦素受体(OB-Rb)及其JAK2/STAT3信号转导通路的影响  68-80
    一、材料与方法  68-70
    二、结果  70-73
    三、讨论  73-80
第三章全文小结  80-81
附图  81-84
附录:缩略词表  84-86
成果  86-89
致谢  89-90

瘦素调控大鼠肝纤维化的信号转导机制及保肝宁的干预作用

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