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人巨细胞病毒影响滋养细胞B7-H1表达水平的体外实验研究

作　者: 赵建华
导　师: 陈素华
学　校: 华中科技大学
专　业: 妇产科学
关键词: 人巨细胞病毒滋养细胞 B7-H1 MAPK 信号转导途径 miR-513 siRNA
分类号: R714.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

【目的】研究人巨细胞病毒(HCMV)对滋养细胞 B7-H1表达水平的影响,MAPK介导的信号转导途径和microRNA对此过程的调控作用,并初步探讨小分子RNA干扰技术干预效果。【方法】1、常规贴壁细胞培养方法培养人胚肺成纤维细胞( Human embryonic lung fibroblast,HEL)以及绒毛外细胞滋养细胞系HPT-8。2、HCMVAD169株体外细胞培养法传毒增殖,Reed-Muench法计算病毒半数细胞感染量TCID50。3、荧光定量PCR检测不同感染滴度HCMV对HPT-8表达B7-H1mRNA水平的影响。4、流式细胞术检测不同感染滴度HCMV对HPT-8表达B7-H1蛋白水平的影响。5、Western-blot检测HCMV诱导HPT-8表达B7-H1过程中的MAPK磷酸化水平,流式细胞术检测MAPK信号转导途径特异性抑制剂对HCMV刺激HPT-8表达B7-H1蛋白水平的影响。6、荧光定量PCR检测不同感染滴度HCMV对HPT-8内MiR-513表达水平的影响。流式细胞术检测HCMV对转染miR-513特异性的Mimics和Inhibitor的HPT-8细胞B7-H1蛋白表达水平的影响。7、设计B7-H1特异性siRNA质粒,构建真核细胞表达载体,流式细胞术检测HCMV对转染B7-H1siRNA的HPT-8细胞B7-H1蛋白表达水平的影响。【结果】1. HCMV AD169毒株TCID50为10-3.29/100ul。2. 2TCID50～200TCID50六个感染滴度的HCMV均可刺激HPT-8表达B7-H1 mRNA和蛋白。其中,100TCID50水平HCMV的刺激作用最强(与空白对照比较,P<0.05)。3. HCMV可以诱导HTP-8细胞中ERK1/2信号转导途径磷酸化。低浓度DMSO、JNK抑制剂SB203580(20μM)和P38抑制剂SP600125(10μM)均不影响HCMV所致的HPT-8细胞表达B7-H1蛋白水平(与空白对照组比较,P>0.05);ERK1/2抑制剂U0126(10μM)可抑制HCMV上调HPT-8表达B7-H1的作用(与空白对照组比较,P<0.05)。4. HCMV感染后,HPT-8细胞中miR-513表达明显降低(P<0.05);HPT-8转染miR-513-Inhibitor后B7-H1蛋白表达水平升高( P<0.05 ); HPT-8转染miR-513-Mimics后,HCMV刺激其表达B7-H1蛋白的作用减弱(P<0.05)。5. B7-H1 siRNA-1、B7-H1 siRNA-2、B7-H1 siRNA-3转染后不同程度抑制HCMV刺激HPT-8细胞表达B7-H1蛋白的作用(P<0.05)。【结论】①HCMV可以诱导滋养细胞表面免疫共抑制分子B7-H1 mRNA及蛋白表达;②ERK1/2信号转导途径激活以及miR-513表达降低可能是HCMV诱导HPT-8表达B7-H1的重要分子机制;③B7-H1 siRNA可以抑制HCMV刺激HPT-8表达B7-H1蛋白的作用。

全文目录

中文摘要  5-7
英文摘要  7-10
前言  10-12
实验准备  12-15
第一部分 HCMV 感染性滴度测定  15-17
  实验方法  15-16
  实验结果  16-17
第二部分 HCMV 对HPT-8 细胞b7-H1 表达水平的影响  17-22
  实验方法  17-19
  实验结果  19-22
第三部分 HCMV 对HPT-8 细胞b7-H1 表达过程中MAPK 磷酸化水平的影响  22-28
  实验方法  22-24
  实验结果  24-28
第四部分 miR-513 对HCMV 刺激HPT-8 表达b7-H1 的影响  28-34
  实验方法  28-30
  实验结果  30-34
第五部分 B7-H1 siRNA 抑制HCMV 诱发b7-H1 表达的初步研究  34-41
  实验方法  34-38
  实验结果  38-41
讨论  41-45
参考文献  45-49
综述  49-61
  参考文献  57-61
致谢  61-62

人巨细胞病毒影响滋养细胞B7-H1表达水平的体外实验研究

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