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Mormyrid电感受叶颗粒细胞对传入纤维动作电位的调控和电突触在电鱼脑内的分布：形态学、电生理学、计算机建模和免疫细胞化学研究

作　者: 张建梅
导　师: 祁金顺；乔健天；Curtis C. Bell
学　校: 山西医科大学
专　业: 生理学
关键词: Mormyrid电鱼电感受器颗粒细胞重合检测(coincidence detection) 非线性相加(non-linear summation) 房室模型(compartmental model) 缝隙连接连接子36 Western blot 免疫组织化学脑片膜片钳
分类号: Q42
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

来自南美洲和非洲的一种淡水电鱼Mormyrid,有着非常发达的小脑和小脑样结构。Mormyrid不仅在尾部有一个能连续放电的电器官(electric organ),而且在身体表面皮肤分布有大量的电感受器(electroreceptors)。因此,这种电鱼的电感受器可以感受由自身电器官发出的分布于电鱼身体周围的电场强度,并将外周信息精确传入中枢,以利捕获猎物、逃避天敌、以及和同类个体之间进行信息交流。这种特殊的信息传导通路,使得Mormyrid成为研究感觉信息传入通路和运动信息传出通路的理想模型之一。电感受器的传入神经纤维终止于电感受叶(electrosensory lobe,ELL)、亦即小脑样结构的表层和深层的颗粒细胞,颗粒细胞继而把信息传向Purkinje-1ike(P-Li)细胞。迄今为止,对颗粒细胞的传入神经通路和颗粒细胞的下一级结构P-Li细胞的研究已较详尽,但对颗粒细胞本身的生理特性以及颗粒细胞对传入信息的处理和整合机制,却知之甚少。电镜研究表明,电感受器传入神经纤维和颗粒细胞之间的联系方式为混合性电突触和化学性突触。在体电生理实验表明,随着刺激强度的增加,电感受器传入神经纤维上的动作电位数量随之增加,而且更为敏感的是缩短了从刺激开始到第一个动作电位发生的潜伏期时程。这表明,感觉传入神经可以通过动作电位的数目,特别是通过第一个动作电位发生的潜伏期长短来编码外周环境的刺激强度。那么,颗粒细胞又是通过什么样的解码机制把传入神经纤维上携带的、反映周围环境变化的信息传递给高一级的中枢呢?过去的研究表明,颗粒细胞在通过感受器接受外周传入信息的同时,也接受由中枢下传的参考信息。外周的传入信息与电鱼周围电场强度和电流密度的改变密切相关,而来自中枢的参考信息则作为指令性信号传递给颗粒细胞。颗粒细胞把外周传入信息与来自中枢的指令信息进行比较、整合,进而向高级中枢进行传递。由此可见,颗粒细胞是研究重合检测(conincidence detection)的一个非常重要的靶点,而这也是我们对颗粒细胞感兴趣的重要原因之一。同时,以往的电生理记录和电镜研究均提示,电鱼脑内广泛分布着电突触(electric synapse,即ephapse),但对组成这些电突触的连接子(connexin)蛋白的组成情况却知之甚少,有待进一步深入探讨。本课题采用可视情况下的脑片全细胞膜片钳技术、注射生物素(biocytin)、神经生物素(neurobicytin)标记细胞、以及染色耦合(dye coupling)技术,并通过建立传入纤维和颗粒细胞之间的电突触联系的计算机模型,对电鱼电感受叶颗粒细胞的形态特征、电生理特性、和突触反应,进行了较详细的观察,以揭示颗粒细胞在电感受传入通路中对外周信息的解码机制,及其在整合传入信号过程中进行精确时间编码(temporalcoding)和重合检测时所起的作用。同时,实验还利用特异性标记神经系统电突触连接子Connexin-36的抗体,用免疫细胞化学和Western blot等技术,分析电鱼Mormyrid脑内构成电突触的连接体(connexon)的分子组成和电突触的分布情况;并用一些束路追踪(tract tracing)手段,对mormirid电感受叶中的神经环路组成作了进一步阐明。第一部分:电感受叶颗粒细胞对电感受传入纤维动作电位的发生和幅度调控的脑片膜片钳研究本实验主要采用全细胞脑片膜片钳技术,对电鱼Mormyrid小脑电感受叶表层和深层颗粒细胞的电生理特性进行了详细研究。实验主要步骤包括麻醉、取脑、切片和电生理记录。脑片用振动切片机制备,厚度为160～250μm,在脑片孵育槽中孵育30分钟后,转入脑片记录浴槽;在红外相差显微镜观察下,通过电刺激器刺激后侧线神经(posteriorlateral line nerve)引发传入冲动;在电流钳或电压钳模式下,记录突触后颗粒细胞产生的兴奋性或抑制性突触后电位/电流(EPSP/IPSP或EPSC/IPSC),经数据采集和膜片钳放大器放大后,用PCLAMP8软件进行分析处理;电生理记录结束后,作细胞内或细胞外注射生物胞素或放置其它示踪剂,准备以后作颗粒细胞的形态及其突起投射情况的观察。实验结果显示:1.细胞内或细胞外注射Biocytin进行细胞标记后均可见,表层颗粒细胞胞体直径约3～5μm,有丰富的底树突,轴突可投射至神经节细胞层(ganglion layer)或分子层底层;深层颗粒细胞胞体直径约5～7μm,只有少量的底树突,其轴突仅投射至网状层(plexiform layer)或神经节细胞层基底部,深层颗粒细胞轴突起始部位较细,离开胞体10～20μm后突然加粗,末端呈爪样分布;放置在切断的神经断端的Neurobiotin进入到传入神经纤维后,可见表层颗粒细胞出现大量反映缝隙连接的染色耦合,而深层颗粒细胞只有少数有耦合标记。2.用单一电刺激兴奋传入神经纤维,可以在表层和深层颗粒细胞记录到“全或无”式的EPSP。通过比较同一细胞的上述突触后反应和细胞内注射不同强度电流引起了分级式EPSPs膜电位变化的不同性质、通过采用电突触阻断剂可降低传入纤维引起的反应幅度而化学性突触阻断剂则无此作用的药理学测试、并且根据传入纤维引起的电变化上升时间非常快而突触延搁非常短(0.4 ms)和此反应可跟随高频率刺激的程度、以及上述传入神经末梢同与之相对的突触后颗粒细胞形成耦合标记等实验事实,再结合以往电镜研究的结果,促使我们得出一个颇为意外的结论,即外周传入在颗粒细胞引起的兴奋性电变化是由电突触而非化学性突触介导的,可称其为eEPSPs(ephatic EPSPs)。3.eEPSP的幅度可随着突触后细胞本身膜电位的改变而改变。eEPSP最大幅度通常出现在膜电位为-65～-110mV之间;在此基础上,在突触后细胞膜电位缓慢去极化时,eEPSP幅度呈线性减小,约在膜电位为-55～-40mV之间时消失;相反,在此基础上当突触后膜电位缓慢超极化时,eEPSP的幅度可突然为零,或突然减小,或缓慢线性减小。这可能是,由于传入纤维和颗粒细胞之间存在高电导的电突触,颗粒细胞突触后膜的电变化也可以通过电突触反向地调控突触前末梢传入冲动的幅度,后者再影响突触后膜的eEPSP。这显示突触后膜电位改变对传入信号的有效调制作用。4.随着刺激电极放置位置的改变,同一颗粒细胞上除了可以记录到“全或无”式的eEPSP外,尚可记录到“全或无”式的IPSP、或者两种电位的复合,表明颗粒细胞有可能分别接受兴奋性、抑制性传入纤维,或同时接受两种不同类型的传入纤维。其中,一些IPSP具有典型的反转电位,也可以被GABAa受体阻断剂Bicuculline所阻断;还有一些IPSP只在突触后细胞膜电位去极化到一定程度时才会发生。由此推测,有些来自电感受器的传入纤维可能先达到一个抑制性中间神经元,后者可能通过不同的机制释放抑制性递质:其中至少有经典的化学性递质释放过程;但也可能不仅依赖突触前递质释放,还依赖突触后颗粒细胞的兴奋或去极化,而由此使大量K~+聚集在颗粒细胞和抑制性中间神经元之间的突触间隙,从而使抑制性中间神经元的末稍发生去极化,并促成抑制性递质的释放。以上结果表明:(1)Mormyrid小脑电感受叶表层和深层的颗粒细胞在结构和功能特性上是完全不同的两类细胞,不仅有胞体分布位置、细胞形态、轴突投射部位的不同,Neurobiotin染色耦合的特点也不同。(2)表层和深层的颗粒细胞均可记录到eEPSP,并且根据染色耦合的实验结果,结合以前的电镜观察,表明传入纤维和颗粒细胞之间存在有电突触。(3)特别值得提出的是,表层和深层颗粒细胞均可由于自身膜电位的改变,通过电突触,对突触前末梢传入进行调控;它是一种尚未报道过的突触传递的调控形式,有特殊的功能意义。合理的解释可能是,当突触后颗粒细胞去极化时,通过高电导的缝隙连接由突触后流向突触前膜的去极化电流会使传入纤维末梢的部分钠通道失活,从而使到达该末梢的动作电位幅度减小,由此在突触后颗粒细胞记录到随突触后细胞去极化幅度而呈线性减小的eEPSP;反之,当突触后颗粒细胞的膜电位超极化时,通过高电导的缝隙连接由突触后流向突触前膜的超极化电流会使传入纤维末梢的钠通道的电驱动力增加,从而使传来的动作电位幅度增加,但过度的超极化电流会使传入纤维末梢过度超极化,这使得正要到来的动作电位因远离其产生阈值而中止传导,从而出现eEPSP的突然消失。突触后细胞超极化时发生的eEPSP幅度突然减小的原因可能是,部分颗粒细胞接收一条以上的传入神经纤维,突触后颗粒细胞的超极化可使其中部分传入纤维末梢的动作电位中断而仅保留另外一些传入纤维末梢的动作电位传入。突触后颗粒细胞的逐级平稳超极化使eEPSP幅度呈渐进的线性降低的原因可能是,突触后颗粒细胞超极化经电突触使传入纤维末梢发生超极化,加之传入纤维末梢因电压门控Na~+通道数量较少而呈现的电缆特性,使得传入末梢的动作电位的幅度随突触后细胞的超极化而减小。以上假说我们将在本研究第二部分建立细胞模型的实验中加以证实(见后)。(4)Mormyrid小脑电感受叶的同一颗粒细胞可以分别或同时接受兴奋性或抑制性的传入纤维,从而产生eEPSP或IPSP。其中,兴奋传入神经纤维引起的eEPSP是仅由电突触介导的,而IPSP则是中间神经元释放抑制性递质所致。IPSP形成机制可能不仅与中间神经元兴奋、抑制性递质释放、亦即经典的化学性突触传递有关,也可能还依赖于突触后颗粒细胞的兴奋以及由此导致的细胞外高钾产生对抑制性中间神经元末梢的兴奋作用有关。总之,以上结果表明了Mormyrid小脑电感受叶表层和深层存在两种完全不同的颗粒细胞,提示它们在信息传递中可能发挥完全不同的作用。两种颗粒细胞均可以通过改变其自身膜电位对传入神经纤维上动作电位的产生与否和大小进行调节,从而对突触后电位的幅度进行调节,如此精细的调节尚未见文献报道。另外,颗粒细胞与传入纤维、抑制性中间神经元以及中枢下传的指令纤维之间的多突触联系方式,和我们观察到的多突触传入的非线性相加现象,均表明颗粒细胞在感觉信息传导通路中起着非常重要的整合作用。这种非线性相加特性对于颗粒细胞保持较高的时间分辨率、进一步向高级中枢传递精确的外界信息,有着非常重要的意义。第二部分:颗粒细胞膜电位对EPSP幅度调节的计算机建模研究在体电生理实验表明,Mormyrid的电感受传入纤维通过其动作电位的数目、尤其是通过动作电位的潜伏期来编码外周信号刺激强度,传入纤维可以通过非常精确的时间分辨来反映周围环境的改变。那么,与感觉传入纤维形成电突触联系的颗粒细胞又是通过何种机制将外周信息精确地传入高级中枢?在第一部分脑片膜片钳实验中,我们已经证实了突触后颗粒细胞自身膜电位变化对突触前传入一末梢动作电位的发生和幅度具有精确的调控。为了进一步检验上述的实验结果和我们对实验结果提出的假设,本实验利用电生理学记录的资料和数据,使用适当的参数,并运用计算机技术,建立了以电突触为联系方式的电感受器传入纤维--颗粒细胞的计算机房室模型(compartmental Model)。在模型程序设计上,使传入纤维具有符合Hodgkin-Huxley理论的Na~+、K~+电流的特性;设计了颗粒细胞胞体具有非失活性的K~+通道,轴突的起始段具有高密度的Na~+通道,而在传入纤维和颗粒细胞之间则具有一些非特异的离子通道表示电突触的存在。结合脑片膜片钳实验结果,模型程序在NEURON软件的环境下运行。该模型的实验结果表明:(1)当传入纤维注入类似动作电位的电流并流经电突触后,可以在突触后的颗粒细胞记录到同电生理记录中得到的结果一样的eEPSPs。(2)所得到的I-V曲线也精确地重复出电生理记录到的外向整流特征。(3)与电生理实验结果相同,颗粒细胞的膜电位可以通过高电导的电突触调控传入神经纤维上传来的动作电位的产生与否和幅度大小,从而控制胞体上记录到的eEPSPs的幅度。当eEPSPs达到最大时,再向胞体注入超极化电流,会使兴奋性的突触后电位突然减小至零;注入胞体去极化电流则导致eEPSPs呈线性降低。(4)通过改变参数,模型模拟了无髓传入神经纤维的活动,再现了膜片钳实验记录中观察到的突触后细胞的膜电位对其EPSPs的调制作用,亦即当eEPSP以最大幅度出现后,随着突触后细胞的逐级平稳地超极化,eEPSP幅度也逐渐减小。以上电感受器传入纤维和颗粒细胞模型的实验结果,准确地重复出了脑片膜片钳实验中观察到的现象,即模拟出eEPSPs、电流-电压曲线、以及颗粒细胞膜电位对传入神经纤维动作电位的产生和幅度的调控等。该模型研究结果进一步证实了由脑片膜片钳实验结果提出的假设,为下一步深入进行更广泛的颗粒细胞模型研究,如兴奋性和抑制性信息在颗粒细胞上的整合,奠定了良好的基础,也为深入研究电感受叶颗粒细胞对外周及中枢传入信息的精确整合机制,提供了一个有用的平台。第三部分:电鱼Mormyrid脑内缝隙连接的分布:免疫细胞化学,分子生物学,和束路追踪研究Mormyrid的中枢神经系统中非常广泛地存在着缝隙连接,这对于电鱼个体和整个种族的生存,如成功捕获猎物、迅速躲避天敌、个体之间信息交流非常重要。根据以往大多数研究报道,Cx36和Cx45(分子量分别为36kD和45kD)是普遍存在于中枢神经系统中构成缝隙连接的连接体水相通道的连接子蛋白单体。故本实验以Cx36和Cx45的多克隆抗体,运用免疫组织化学、western blot,结合biotinylated-dextran amine(BDA)顺行和逆行追踪标记、双标染法、和激光共聚焦显微镜成像技术等实验手段,对缝隙连接连接子蛋白Cx36和Cx45在电鱼脑内的分布情况进行了研究,旨在分析缝隙连接的连接子蛋白(每6个连接子蛋白单体组成一个六聚体的水相通道,称为connexon,即连接体)和连接体的结构和组成,以便对电感受信号的传入通路及命令信号的传出通路做进一步的理解,进一步分析它们可能对电感受信号的传导通路作出的影响。实验结果表明:1.Western blot实验结果显示,在Mormyrid脑组织中,Cx36抗体可检测到分子量为35kD和70kD的蛋白肽段,Cx45抗体却未能显示出分子量为45KD的蛋白肽段。然而在大鼠脑组织中,Cx45抗体能特异性地检测到分子量为45kD蛋白肽段。这表明,Mormyrid脑内的缝隙连接可能不存在连接子蛋白Cx45。2.使用Cx36抗体,我们成功地标记了以往公认的存在有缝隙连接的部位,如电感受叶的深层颗粒细胞、电感受叶神经核(nELL)、半规隆凸外侧核(ELa)、命令神经核(CN)、延髓中继核(MRN)、以及Maunthner细胞等。3.使用生物素化右旋糖胺(BDA)逆行标记法,发现了以前未曾报道过的一些存在缝隙连结的区域,如前命令核(PCN)、腹背侧核(VPN)、隆起前核(PE)、网状—脊髓神经元以及次级听神经核等。4.使用BDA顺行标记法,成功地显示了命令神经元所在核CN的传导通路和它的侧支通路(corollary pathway),侧支通路包括延髓命令相关核(BCA)、中脑命令神经元(MCA)、旁叶核(JLNm)、旁三叉神经命令相关核(PCA)等。然而,令人感兴趣的是,与侧支通路有关的这些部位的Cx36抗体标记均呈现阴性结果。5.电感受叶表层颗粒细胞的Cx36抗体标记也呈现阴性结果。我们用脑片膜片钳记录的eEPSP、注射Neurobiotin染色耦合、以及过去电镜研究结果,均表明在电感受传入纤维和表层的颗粒细胞之间存在着大量高电导的电突触。然而本实验用Cx36抗体进行的免疫组化研究,却显示了阴性的结果。这说明表层颗粒细胞上不存在Cx36,但这并不能除外表层颗粒细胞存在电突触。有资料表明,缝隙连接还可由其他连接子蛋白构成。有报道指出,Pannexin构成的连接体比Connexin构成的连接体具有更高的通透性,其孔道直径比Connexin组成的连接体更大。表层颗粒细胞是否存在着由Pannexin等构成的电突触,还有待进一步的研究。有报道表明,命令传导通路的侧支通路传递更为精确的参考信息,通过五级的突触传递后,其时间偏差只有0.05ms,因而推测如此精确的传导应当是通过非电突触介导莫属。然而侧支通路神经元Cx36标记的阴性结果,让我们不得不重新考虑这个问题。我们推测,命令传导通路的侧支通路可能存在有不同于Cx36和Cx45的其它连接子蛋白,亦或可能侧支通路原本就是由化学性突触所介导的。如果这样,这将可能是一些非同寻常的、可以精确传递信息的化学性突触。小结在本研究中我们首次发现,突触后颗粒细胞可以通过改变其自身膜电位,通过电突触,对传入神经纤维上的动作电位的产生与否和幅度大小进行调节,从而对突触后电位的进行精细调节;同时,传入纤维和颗粒细胞具有的多突触联系方式和表现出的非线性相加现象,证实了颗粒细胞在感觉信息传导通路中发挥着重要的整合作用,为颗粒细胞所具有的高时间分辨率和精确传递外界信息的功能,提供了理论依据;模型实验研究成功地再现了电生理实验的研究结果,为下一步进行更深入的颗粒细胞模型研究,也为深入研究电感受叶颗粒细胞对外周及中枢传入信息的精确整合机制提供了一个可靠平台;免疫细胞化学标记电鱼脑内电突触组成的实验结果,既发现了新的缝隙连接分布区域,又提示了连接体蛋白构成的多样性,以及电鱼脑内还存在有特殊的、能够精确传递信息的化学性突触的可能性,为进一步全面研究电鱼脑内的突触传递提供了新思路。

全文目录

Abstract (in Chinese)  6-12
Abstract (in English)  12-19
Part I: Granular Cells of the Mormyrid Electrosensory Lobe and Postsynaptic Control over Presynaptic Spike Occurrence and Amplitude through an Electrical Synapse  19-58
  Abstract  20-21
  Introduction  21-22
  Materials and Methods  22-26
  Results  26-48
  Discussion  48-55
  References  55-58
Part II: Postsynaptic Modulation of Ephaptic EPSP Size Analysis: a Modeling Study by Computerized simulation  58-68
  Abstract  59
  Introduction  59-61
  The model parameteres  61-63
  Results  63-66
  Discussion  66-67
  References  67-68
Part III: Identification of Gap Junctions and Some Circuitry Tracing in Brain of Mormyrid Electric Fish: Immunocytochemical, Molecular Biological, and Tract Tracing Analyses  68-97
  Abstract  69
  Introduction  69-71
  Materials and Methods  71-75
  Results  75-88
  Discussion  88-93
  References  93-97
Review: Gap Junctions in the Nervous System  97-119
  Abstract  98
  Introduction  98-100
  Comparison between chemical synapse and electrical synapse  100-104
  The impact of gap junction  104-105
  plasticity of Electrical synapses  105-107
  General characteristics of connexins and Pannexins  107-109
  Gap junctions in inferior olive  109-110
  Gap junctions in hippocampus  110-112
  What's next?  112-113
  References  113-119
Resume  119-121
Acknowledgements  121

Mormyrid电感受叶颗粒细胞对传入纤维动作电位的调控和电突触在电鱼脑内的分布：形态学、电生理学、计算机建模和免疫细胞化学研究

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