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卡那霉素和速尿导致豚鼠耳聋及其基因治疗的探索性研究

作　者: 张贤芬
导　师: 韩东一；杨仕明
学　校: 中国人民解放军军医进修学院
专　业: 耳鼻咽喉科学
关键词: 豚鼠卡那霉素速尿听觉诱发电位听功能毛细胞听神经凋亡基因治疗 Hath1基因
分类号: R764.43
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

感音神经性聋严重影响着人类的健康和生存质量,但目前尚无有效治疗方法,一般认为,毛细胞再生是治疗感音神经性聋的关键。近几年对听觉和听力损失分子机理的理解,结合基因和分子治疗内耳疾病的进步给临床治疗感音神经性聋提供了可行性,使基因治疗有望成为治疗内耳疾病的新技术。本研究拟行药物性聋动物模型建立及其评价,并进行内耳Hafhl基因导入诱导毛细胞再生,探索基因治疗的可能性。分为以下三个部分。第一部分卡那霉素和速尿联合用药后豚鼠听功能损害试验豚鼠肌肉注射硫酸卡那霉素(500mg/kg)2小时后给予速尿(50mg/kg)静脉注射,分别于用药3天、7天及2月行听觉脑干诱发电位(auditory brainstem response ABR)检测,用药3天行听神经复合动作电位(compound action potential CAP)及耳蜗微音电位(cochlear microphonicCM)检测,对试验组和对照组豚鼠耳蜗听功能结果进行统计学分析,结果发现豚鼠耳毒性药物敏感性不同,仅约半数豚鼠出现听功能严重受损(ABR阈值>95dBSPL);用药3天组各频率短纯音诱发的ABR阈值(2kHz,4kHz,8kHz,16kHz)明显比对照组提高(p<0.01),而用药3天组、用药7天组和用药2月纽各频率ABR阈值比较无差别(p>0.05);发现部分豚鼠用药后CAP阈值轻度提高,但是CM明显异常;用药2月后严重致聋豚鼠听力无恢复。结论:卡那霉素和速尿联合用药可导致约半数豚鼠听功能严重受损并且用药2月致聋豚鼠听力无恢复。卡那霉素和速尿联合用药是建立药物性聋动物模型的—种快速且较可靠的方法。第二部分卡那霉素和速尿联合用药后豚鼠耳蜗毛细胞和听神经损害观察对药物损伤致聋豚鼠(ABR阈值>95dBsPL)进行耳蜗切片铺片、扫描电镜及毛细胞死亡模式观察,发现耳蜗毛细胞严重受损,以外毛细胞(OHCs)缺失为主,耳蜗第一、二回毛细胞缺失比第三、四回严重,严重致聋的豚鼠内毛细胞(IHCs)也广泛缺失,但是切片显示柯替氏器的支持细胞存在;联合用药1周开始豚鼠的听神经出现损害,与OHCs连接的神经纤维损害为主:随着用药时间延长,听神经损害加重,而且耳蜗第一、二回听神经损害比第三、四回严重;扫描电镜发现耳蜗第一、二回IHCs和OHCs静纤毛散乱、融合,毛细胞全部被瘢痕替代。发现KM/速尿给药6小时豚鼠耳蜗出现OHCs核固缩和核肿胀,给药9小时豚鼠耳蜗OHCs核肿胀数目增多,OHCs核固缩和核肿胀多见于耳蜗第一回,豚鼠耳蜗各回IHCs显示正常毛细胞特征。给药6小时和给药9小时豚鼠耳蜗用TUNEL技术检测凋亡DNA片段,没有观察到阳性着色细胞。结论:卡那霉素和速尿联合用药后不仅有毛细胞广泛缺失,而且伴随听神经损害,随着用药时间延长,听神经损害加重;毛细胞死亡模式有凋亡和坏死两种方式。第三部分卡那霉素和速尿致聋豚鼠的Hathl基因治疗对致聋豚鼠(ABR阈值>95dBSPL)进行基因治疗探索性研究。致聋豚鼠经完整圆窗膜途径导入促进毛细胞再生的Hathl基因,结果发现用药4周、用药8周ABR阈值与用药前相比没有差别;与导入前相比较,所有空白对照组和导入人工淋巴液的豚鼠导入耳没有发现毛细胞增多或再生,10只导入Ad.Hathl-EGFP豚鼠中只有1只导入耳耳蜗第三回毛细胞明显比未导入耳增多。致聋豚鼠经腹侧入路暴露听泡,去除部分听泡骨暴露鼓阶,于鼓阶近圆窗处打孔微量注射器导入Hathl基因,结果发现非导入耳ABR阈值导入前后无改变,导入耳ABR阈值与自身非导入耳比较无明显差别,导入耳组ABR阈值与对照组比较无差别;4只导入Ad.Hathl-EGFP豚鼠中,有3只豚鼠导入耳耳蜗毛细胞明显比未导入耳增多。结论:致聋豚鼠经鼓阶打孔显微注射Ad.Hathl-EGFP,发现导入耳毛细胞增多;鼓阶打孔途径明显优于完整圆窗膜途径。致聋豚鼠听力改善可能需要多基因联合导入。

全文目录

中英文缩略词表  6-7
中文摘要  7-9
英文摘要  9-12
前言  12-20
  参考文献  18-20
第一部分卡那霉素和速尿联合用药后豚鼠听功能损害  20-33
  前言  20
  材料和方法  20-22
  结果  22-29
  讨论  29-31
  参考文献  31-33
第二部分卡那霉素和速尿联合用药后豚鼠内耳毛细胞和听神经损害观察  33-62
  前言  33-34
  (一)卡那霉素和速尿联合给药后的耳蜗切片及电镜观察  34-44
    材料和方法  34-41
    结果  41-44
  (二) 卡那霉素和速尿联合用药后的听神经损害观察  44-48
    材料和方法  44-46
    结果  46-48
  (三)卡那霉素和速尿联合用药后的毛细胞死亡模式观察  48-52
    材料和方法  48-49
    结果  49-52
  讨论  52-59
  小结  59-60
  参考文献  60-62
第三部分卡那霉素和速尿联合用药后豚鼠耳聋基因治疗探索  62-85
  前言  62-63
  (一)经完整圆窗膜途径导入Hath1基因  63-67
    材料和方法  63-64
    结果  64-67
  (二)经耳蜗鼓阶打孔途径导入Hath1基因  67-75
    材料和方法  67-69
    结果  69-75
  讨论  75-80
  小结  80-81
  参考文献  81-85
文献综述  85-101
攻读博士学位期间发表论文情况  101-103
致谢  103-104

卡那霉素和速尿导致豚鼠耳聋及其基因治疗的探索性研究

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