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人工抗凋亡促进胚胎发育的研究

作　者: 李红
导　师: 邢福祺
学　校: 南方医科大学
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: 颗粒细胞凋亡 Bax Bak 鼠胚 Bak Bax 胚胎移植染色体
分类号: R321-33
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

卵细胞和胚胎的衰老和死亡是制约体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization embryo transfer，IVF-ET)等辅助生殖技术(assisted reproduetive techniques，ART)成功率提高的一个关键因素。而细胞凋亡是卵细胞和胚胎死亡的主要方式，也是导致卵细胞受精障碍和胚胎发育停滞、着床失败的主要原因。可以设想，若能抑制卵细胞和胚胎的凋亡，将显著提高胚胎的质量及辅助生殖的成功率。导致细胞凋亡的原因很多，抗凋亡分子和促凋亡分子在调节卵细胞和胚胎细胞凋亡方面起着极为重要的作用，它们之间的平衡决定着细胞的存活和死亡。其中，Bcl-2家族起着重要的作用，Bax、Bak是其亚家族中的成员，具有促凋亡作用。本研究从一个全新的角度，首次提出通过抗凋亡人工干预的方法来促进胚胎发育。我们以人颗粒细胞和小鼠早期胚胎为研究对象，采用基因转染法，在人颗粒细胞和小鼠胚胎内转入Bax、Bak等凋亡分子的小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，通过干扰Bax等凋亡分子mRNA表达从而提升Bcl-2等抗凋亡分子的含量比例等方法分析体外人工抗凋亡干预措施对早期胚胎发育的影响，寻找一条提高卵子和胚胎质量的新途径，也为提高胚胎干细胞培养中的囊胚形成率奠定一定的基础，从而为最终将抗凋亡干预应用于临床不孕症辅助治疗提供理论和实验依据。第一部分干扰Bax-Bak基因表达目的通过转染Bax、Bak小分子干扰RNA(siRNA)，干扰Bax、Bak等凋亡分子的功能，研究其对人颗粒细胞凋亡的影响，为提高卵子、胚胎质量提供新的思路及理论依据。方法1、用Westernblot检测Bax、Bak-siRNA；2、将Bax、Bak-siRNA分别或同时转染入人颗粒细胞，观察基本形态，用流式细胞仪检测颗粒细胞的凋亡。3、实验设置空白对照组、阳性对照组、阴性对照组、Bax干扰组、Bak干扰组、gax-Bak干扰组。结果1、esternblot检测：转染了Bax-siRNA和Bak-siRNA后的条带减弱，说明细胞内Bax、Bak含量降低。2、基本形态观察：1)空白对照组、Bak干扰组、Bak+Bax干扰组细胞形态正常，多为多边形和梭形，以贴壁为主。2)Bax干扰组细胞形态基本正常，胞质中有少数黑点，多为多边形和梭形，以贴壁为主。3)阳性对照组、阴性对照组细胞变圆，收缩，细胞间距大，胞质中有较多黑点。3、流式细胞仪检测结果：1)Bak干扰组的凋亡指数为3.44％，BaxBak联合干扰组的凋亡指数为3.97％，明显低于阴性对照。2)Bax干扰组的凋亡指数为19.98％，与阴性对照组相似。结论1、干扰Bak等凋亡分子的表达，可以抑制颗粒细胞的凋亡。2、Bak干扰组以及BaxBak联合干扰组抗颗粒凋亡效果显著。3、Bax干扰组抑制颗粒细胞凋亡的作用不明显。第二部分人工干预小鼠胚胎细胞凋亡目的通过转染Bax-siRNA和Bak-siRNA，研究其对鼠胚凋亡的影响，寻找干预胚胎的凋亡、促进胚胎发育的新途径。方法1、激光打孔转染FAM标记的阴性siRNA，荧光检测转染方法是否可行。2、通过激光打孔分别以及同时将Bax、Bak-siRNA转入小鼠胚胎，进行普通形态、卵裂观察；并计算囊胚形成率。3、通过激光打孔分别以及同时将Bax、Bak-siRNA转染入小鼠胚胎，Hoechst33342和PI荧光染色检测凋亡，并计数凋亡细胞。4、免疫荧光检测Bak、Bax的表达，并检测其光密度与阴性对照比较。5、分别用荧光检测Bak及Bax干扰组中caspase-3前体的表达。结果1、转染FAM标记的阴性siRNA的胚胎有荧光，证明转染方法有效。2、囊胚形成率：空白对照组81.0％，阴性对照组69.5％，Bak干扰组92.5％，Bax干扰组74.0％，联合干扰组89.5％。其中，Bak干扰组、联合干扰组与阴性对照有显著差异，p＜0.001；Bax干扰组与阴性对照无显著差异，p=0.318；阴性对照与空白对照有差异，p=0.011。3、Hoechst33342和PI染色检测细胞凋亡：空白对照组26.0％，阴性对照组33.0％，Bak干扰组17.6％，Bax干扰组30.5％，联合干扰组19.1％；与阴性对照组比较，Bak干扰组和联合干扰组均有显著差异，p＜0.001；但Bax干扰组无显著差异，p=0.470。4、荧光检测Bak、Bax的表达：Bax干扰组及其阴性对照组光密度分别为25.39±4.73、52.89±3.91，前者显著减弱p＜0.001；Bak干扰组及其阴性对照组光密度分别为：17.10±3.79、35.26±4.88，前者显著减弱p＜0.001；联合干扰组及其阴性对照组光密度分别为：TRITC标记组：19.68±4.86、35.26±4.88；前者显著减弱p＜0.001；FITC标记组：32.78±3.73、52.89±3.91，均为前者显著减弱p＜0.001。5、荧光检测caspase-3前体的表达。Bak干扰组及其阴性对照中caspase-3光密度分别为：65.68±4.79、30.24±3.40，p＜0.001，有显著差异；Bax干扰组及其阴性对照中caspase-3光密度分别为：31.48±2.65、30.24±3.40，p=0.318，无显著差异。结论1．首次在小鼠胚胎上应用激光打孔后转染的实验方法。2．在转染Bak／Bax-SiRNA后，Bak和Bax的表达减弱。3．在Bak干扰和联合干扰组中，鼠胚的凋亡细胞数明显减少，囊胚的形成率明显增加；而在Bax干扰组中，胚胎的凋亡细胞数、囊胚形成率与阴性对照相比无明显改变；说明Bak干扰以及Bak-Bax联合干扰对于抑制鼠胚的凋亡是有效的。4．鼠胚中caspase-3前体的表达在Bak干扰组中增强；在Bax干扰组中无明显变化。第三部分鼠胚移植与染色体检测目的1、初步研究鼠胚在进行抗凋亡处理后是否能发育至成熟个体。2、初步观察出生小鼠是否有生理缺陷及染色体异常。方法1、挑选Bak／Bax干扰组及联合干扰组中发育较好的囊胚各10个移植入小鼠子宫；观察出生小鼠的基本情况。2、出生小鼠染色体的检查。结果1、Bak干扰组共出生6只小鼠，Bax干扰组和联合干扰组均出生5只小鼠，出生小鼠均无明显畸形和行为异常。2、出生小鼠染色体无明显异常。结论1、经Bak、Bax抗凋亡处理的鼠胚可以正常发育至成熟个体。2、抗凋亡处理对出生小鼠无明显影响。3、抗凋亡处理对出生小鼠染色体无明显影响。

全文目录

中文摘要  3-8
Abstract  8-19
前言  19-29
第一部分干扰Bax-Bak基因表达抑制人颗粒细胞凋亡  29-42
  第一节 siRNA效果检测  29-34
    1.材料  30-32
    2.方法  32-33
    3.结果  33-34
  第二节颗粒细胞抗凋亡检测  34-42
    1.材料  34
    2.方法  34-35
    3.结果  35-39
    4.讨论  39-41
    5.结论  41-42
第二部分人工干预小鼠胚胎细胞凋亡  42-63
  第一节小鼠胚胎的收集和培养  43-48
    1.材料  43-44
    2.方法  44-46
    3.结果  46-48
  第二节鼠胚细胞凋亡检测  48-52
    1.材料  48-49
    2.方法  49
    3.结果  49-52
  第三节鼠胚Bak、Bax、caspase-3表达检测  52-63
    1.材料  52
    2.方法  52-53
    3.结果  53-58
    4.讨论  58-62
    5.结论  62-63
第三部分鼠胚移植与染色体检测  63-73
  第一节小鼠胚胎的移植  63-67
    1.材料  63-64
    2.方法  64-66
    3.结果  66-67
  第二节小鼠染色体的制备  67-73
    1.材料  67-69
    2.方法  69-70
    3.结果  70-71
    4.讨论  71-72
    5.结论  72-73
全文小结  73-74
参考文献  74-79
综述  79-88
  参考文献  85-88
缩略词表  88-89
在读期间发表文章  89-90
致谢  90-91

人工抗凋亡促进胚胎发育的研究

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