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RNAi沉默Smad3对瘢痕疙瘩成纤维细胞功能的影响

作　者: 果磊
导　师: 任国胜
学　校: 重庆医科大学
专　业: 外科学
关键词: 电穿孔介导法 增强型绿色荧光蛋白 瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFB) 荧光显微镜 流式细胞术 脂质体介导法 小分子RNA干扰(RNAi) Smad3基因 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) Western Blot TGF-β/Smads RNAi 细胞增殖 凋亡 MMP-3
分类号: R622
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


第一部分电穿孔介导法转染成纤维细胞参数的优化目的:通过电穿孔法将增强型绿色荧光蛋白基因真核表达载体pEGFP-N1质粒导入原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞,探讨影响外源基因电转染效率的参数,如电压、脉冲长度、DNA剂量以及转染后时间长度等。方法:在大肠杆菌中扩增pEGFP-N1质粒,选择不同的电压梯度、脉冲长度及DNA剂量,采用电转仪将pEGFP-N1质粒导入原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞,用荧光显微镜观察转染后不同时间pEGFP-N1瞬时表达情况及细胞存活情况,流式细胞仪检测其转染效率。结果:在电压为250v、脉冲数1、脉冲长度150μs、DNA质粒6μg时,电穿孔法将pEGFP-N1质粒导入瘢痕疙瘩成纤维细胞转染率最高,细胞存活率最高,转染后24h明显表达,48h后表达最强。48h后流式细胞仪检测其表达率为32.77%。结论:在适当的电压、脉冲长度下,选择适当的DNA用量,在转染后一定的时间范围内,电穿孔法转染原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞可使目的基因获得较高的转染率,且细胞死亡最少。电穿孔法是研究原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学行为较为理想的转染方法。第二部分脂质体介导法转染成纤维细胞参数的优化目的:通过脂质体介导法将增强型绿色荧光蛋白基因真核表达载体pEGFP-N1质粒导入原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞,探讨影响外源基因脂质体转染效率的参数,如DNA剂量、脂质体浓度、转染时间等。方法:在大肠杆菌中扩增pEGFP-N1质粒,选择不同的DNA剂量、脂质体浓度、转染时间,应用脂质体将pEGFP-N1质粒导入原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞,用荧光显微镜观察转染后24h及48h后pEGFP-N1瞬时表达情况及细胞存活情况。结果:当细胞铺瓶达70%-80%、细胞数为1-2x109cells/L时,6μg的pEGFP -N1质粒DNA按1:1的比例加入脂质体,在无血清条件下转染成纤维细胞4h,转染后24h转染明显,转染后48h达最高为38.61%,且细胞活性较高。结论:在适当的脂质体浓度下,选择1:1的比例加入DNA质粒,在转染较短的时间内,脂质体法转染原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞可使目的基因获得较高的转染率,且细胞死亡最少。脂质体法是研究原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学行为较为理想的转染方法。第三部分SiRNA-Smad3对瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad3基因表达的影响目的:探讨SiRNA-Smad3对人瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad3基因表达的影响。方法:采用小分子RNA干扰(RNAi)技术,以阳离子脂质体为载体,将3对化学合成的SiRNA-Smad3(Y1、Y2、Y3)分别转染体外培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFB),同时以未转染SiRNA-Smad3的KFB为对照,干扰Smad3的表达以阻碍内源性TGF-β/Smads信号的转导;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法和Western Blot检验SiRNA-Smad3干扰Smad3表达的效果;采用免疫荧光化学法检测Smad3干扰前后KFB中Dmad3表达位置的变化情况。结果:RNAi技术可有效干扰KFB中Smad3MRNA和蛋白的表达,用RT-PCR方法测定Y1组Smad3MRNA的表达最弱, Western Blot检验结果与RT-PCR方法一致;Smad3的干扰导致Smad3在细胞质中表达降低,细胞核内几乎没有表达。结论:SiRNA-Smad3作用于人瘢痕疙瘩成纤维细胞后能特异性地抑制Smad3的mRNA和蛋白的表达,并导致Smad3在细胞质中表达降低,细胞核内几乎没有表达。第四部分转化生长因子(TGF)-β/Smads对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及凋亡的影响目的:研究TGF-β/Smads对人瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFB)增殖及凋亡的调控作用。方法:用脂质体法将SiRNA-Smad3转染原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞,应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测阻碍内源性TGF-β/Smads信号转导和以外源性TGF-β1刺激这两种条件下KFB的生长情况;采用流式细胞术检测上述两种条件下细胞周期及凋亡情况。结果:内源性TGF-β/Smads信号转导受阻不但抑制KFB的生长,并且诱导细胞凋亡;外源性、较高浓度的TGF-β1可促进KFB的生长,但不诱导凋亡。结论:TGF-β/Smads在一定浓度范围内可调控KFB的生长和凋亡。胞增殖,凋亡第五部分TGF-β/Smads对人瘢痕疙瘩成纤维细胞中MMP-3表达的影响目的:研究TGF-β/Smads对人瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFB)中MMP-3表达的调控作用。方法:用脂质体法将SiRNA-Smad3转染原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞,应用免疫组化法检测阻碍内源性TGF-β/Smads信号转导和以外源性TGF-β1刺激这两种条件下KFB中MMP-3的表达情况。结果:内源性TGF-β/Smads信号转导受阻导致KFB中MMP-3表达增强;外源性、较高浓度的TGF-β1可抑制KFB中MMP-3的表达。结论:Smad3可以介导TGF-β1信号抑制MMP-3在KFB中的表达。

全文目录


英汉缩略语名词对照  6-8
中文摘要  8-13
英文摘要  13-20
论文正文：RNAi 沉默Smad3 对瘢痕疙瘩成纤维细胞功能的影响  20-98
  前言  20-25
  第一部分 电穿孔介导法转染成纤维细胞参数的优化  25-36
    1 材料和方法  25-29
    2 结果  29-33
    3 讨论  33-34
    参考文献  34-36
  第二部分 脂质体介导法转染成纤维细胞参数的优化  36-47
    1 材料和方法  36-39
    2 结果  39-43
    3 讨论  43-45
    参考文献  45-47
  第三部分 SiRNA-Smad3 对瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad3 基因表达的影响  47-63
    1 材料和方法  47-56
    2 结果  56-58
    3 讨论  58-61
    参考文献  61-63
  第四部分 转化生长因子（TGF）-β-/Smads 对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及凋亡的影响  63-75
    1 材料和方法  63-67
    2 结果  67-70
    3 讨论  70-73
    参考文献  73-75
  第五部分 转化生长因子（TGF）-ββ/Smads 对人瘢痕疙瘩成纤维细胞中 MMP-3 表达的影响  75-83
    1 材料和方法  75-77
    2 结果  77-78
    3 讨论  78-81
    参考文献  81-83
  图片  83-97
  全文总结  97-98
综述一  98-112
综述二  112-122
课题创新性  122-123
致谢  123-124
攻读博士期间发表论文及参加申请的课题  124

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中图分类: > 医药、卫生 > 外科学 > 整形外科学（修复外科学） > 整形手术学
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