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Nell-1基因转染犬骨髓基质干细胞的成骨实验研究

作　者: 陈明
导　师: 倪龙兴
学　校: 第四军医大学
专　业: 口腔内科学
关键词: 组织工程骨髓基质干细胞 Nell-1 逆转录病毒载体
分类号: R78
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

各种原因造成的大段骨缺损的修复是临床极为棘手的问题。组织工程(tissue engineering)技术,特别是基因强化组织工程(gene-enhanced tissue engineering)技术的出现给人们提供了可能最终解决问题的理想途径。骨髓基质干细胞(Bone marrow stromal cell, BMSc)目前被认为是骨组织工程最有价值的种子细胞,是目前基因强化组织工程骨常用的靶细胞。Nell-1(Nel-like,type1molecule,Nel样I型分子)作为一种新克隆的成骨基因,具有明显的成骨作用,其产物蛋白可作为骨组织工程中一种新的生长因子,并且Nell-1蛋白只作用于颅颌面的成骨细胞,具有生物学特异性。目前,将Nell-1基因转染BMSc应用于颌骨组织工程研究,国内外尚无相关报导。在本研究中我们构建了含重组人Nell-1基因的逆转录病毒载体并转染犬BMSc,并对其复合纤维蛋白胶(Fibers Glue, FG)生物材料后修复犬下颌骨2.0cm x1.5cm x0.5cm骨缺损的能力进行评价,从而探讨建立利用经Nell-1基因转染的BMSc构建组织工程化骨组织的方法。我们通过(1)构建Nell-1逆转录病毒载体(PLNCX2- Nell-1),制备含Nell-1目的基因的重组逆转录病毒液,感染犬骨髓基质干细胞,使用原位杂交、RT-PCR以及免疫组织化学的方法检测Nell-1在BMSc中的表达。(2)采用Rhodamine phalloidin-DAPI荧光染色,定量分析了Nell-1转染对BMSc细胞伸展性的影响,采用Jet impingement系统检测Nell-1转染对BMSc细胞粘附性的影响,采用MTT法对比分析经转染与未经转染BMSc的增殖情况,NPP法检测细胞碱性磷酸酶(ALP)合成情况,3H脯氨酸掺入方法检测胶原合成情况,放射免疫方法测定细胞骨钙素(BGP)、层粘连蛋白(LN)合成情况。(3)制备Beagle犬下颌骨2.0cm×1.5 cm×0.5 cm缺损实验模型,单纯病毒液修复实验分为4组:PLNCX2-Nell-1+ FG修复组; PLNCX2+ FG修复组;单纯FG生物材料修复组;空白组,未加任何填充材料,于术后采用大体观察、X线观察、组织学观察方法对骨缺损修复情况进行对比检测。(4)将制备的病毒液转染BMSc,利用经转染的BMSc修复犬下颌骨2.0cm×1.5 cm×0.5 cm骨缺损。修复实验也分为4组:经转染细胞+ FG修复组;未经转染细胞+ FG修复组;单纯FG生物材料修复组;空白组,未加任何填充材料。采用大体观察、X线观察、组织学观察、免疫组织化学等方法对骨缺损修复情况进行对比检测。研究结果发现:(1)构建的Nell-1逆转录病毒载体中外源基因方向、序列均正确、无碱基缺失及突变现象。原位杂交、RT-PCR以及免疫组织化学检测显示经PLNCX2- Nell-1病毒液感染的BMSc中有较强的阳性结果出现,而PLNCX2空载体转染的BMSc以及未转染的BMSc中极少见阳性表达结果。(2)经PLNCX2- Nell-1病毒介导的基因转染的犬BMSc增殖能力无明显改变,其细胞伸展面积和细胞粘附力提高,同时其合成胶原、ALP、BGP、层粘连蛋白的能力能够得到显著提高,与PLNCX2病毒液转染、未经转染的BMSc相比有显著性差异。(3)PLNCX2- Nell-1重组病毒液与FG生物材料复合修复组可见在缺损处有骨性连接形成,组织学观察见有大量新生骨组织形成,而PLNCX2病毒液+FG修复组、单纯材料修复组和空白组组均未见骨性连接形成,仅在部分骨缺损两断段形成少量骨组织。(4)大体观察、X线、组织学检测分析结果证实经转染的BMSc修复骨缺损的成骨速度和成骨量均优于未转染BMSc修复组,单纯FG生物材料修复组和空白组中均未见骨缺损得到修复。根据以上结果,得出以下结论:(1)采用逆转录病毒介导的方法可以将Nell-1转染至BMSc中,并有外源Nell-1的表达。(2)PLNCX2- Nell-1基因转染能够促进体外培养的BMSc向成骨细胞转化,增强其细胞粘附力,并对其增殖能力没有显著影响。(3)采用PLNCX2- Nell-1重组病毒液与生物材料复合的方法能够修复犬下颌骨2.0cm×1.5 cm×0.5 cm缺损。(4)PLNCX2- Nell-1基因转染能够提高BMSc形成组织工程化骨组织和修复骨缺损的能力。(5)采用Nell-1基因转染的方法能够提高BMSc体内外成骨能力,可用于以BMSc为种子细胞的组织工程化骨组织的构建和进一步应用。

全文目录

缩略词表  5-6
中文摘要  6-9
英文摘要  9-13
前言  13-14
文献回顾  14-27
正文  27-88
  实验一 Nell-1 基因转染犬骨髓基质干细胞  27-46
    1 材料与方法  27-37
    2 结果  37-42
    3 讨论  42-46
  实验二 Nell-1 基因转染对犬骨髓基质干细胞体外生物学表现的影响  46-61
    1 材料与方法  46-52
    2 结果  52-57
    3 讨论  57-61
  实验三含Nell-1基因病毒液复合可吸收纤维蛋白胶修复犬下颌骨缺损  61-71
    1 材料与方法  61-64
    2 结果  64-68
    3 讨论  68-71
  实验四 Nell-1 基因转染骨髓基质干细胞构建组织工程骨修复犬下颌骨缺损  71-88
    1 材料与方法  71-76
    2 结果  76-84
    3 讨论  84-88
全文小结  88-89
参考文献  89-102
个人简历和研究成果  102-103
致谢  103

Nell-1基因转染犬骨髓基质干细胞的成骨实验研究

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