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逆转录病毒载体介导的人溶菌酶基因在乳腺细胞的表达

作　者: 兰志刚
导　师: 张涌
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 溶菌酶基因乳腺上皮细胞基因表达逆转录病毒载体
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目前大多数转染实验使用的是脂质体瞬时转染,外源基因随着细胞的传代可能丢失。近来,由于逆转录病毒载体显示出外源基因能高效、稳定地转入宿主基因组,被广泛应用于人和动物的基因治疗及转基因动物制作。本研究利用目前应用较多也更为安全的LN系列载体—pLNCX2,将人溶菌酶(hLYZ)基因转入牛乳腺上皮细胞中,并在小鼠乳腺癌细胞中进行基因表达的检测的研究。一、人溶菌酶基因乳腺特异性表达载体的构建本研究所用的重组逆转录病毒载体是以莫罗尼小鼠白血病病毒和莫罗尼淑肉瘤病病毒为基础的pLNEX2载体为骨架,以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因为报告基因,以pMD18-T为克隆载体进行构建的。首先,分别用BglII和XhoI双酶切含有报告基因egfp的重组质粒pMD-EGFP和逆转录病毒载体pLNCX2,将通过琼脂糖凝胶电泳回收的目的片段egfp和线性化的pLNCX2产物于4℃水浴过夜连接、转化、挑取单菌落、提取质粒,利用BglII和XhoI双酶切鉴定并将正确重组质粒命名为pLE;然后,分别用NotI和SalI双酶切含有BBC3基因重组质粒pMD-BBC3和重组质粒pLE,按照上述操作获得正确重组质粒并命名为pLEB;最后,再分别用XhoI和BamHI双酶切重组质粒pLEB和乳腺表达载体pEBH,连接、转化、提取质粒和双酶切鉴定。通过以上操作得到含有egfp、bbc5、hLYZ和bbc3基因的重组逆转录病毒质粒,并命名为pLEBH。二、牛乳腺上皮细胞的培养及转染取牛乳腺组织送实验室后,经自来水、生理盐水、含双抗的PBS多次清洗,剪碎,于培养皿中培养,纯化,传代,冻存以及细胞的解冻。将构建好的重组逆转录病毒载体pLEBH用脂质体2000转入病毒包装细胞PA317中,收集病毒液,测定病毒滴度,用高病毒滴度的病毒液来感染牛乳腺上皮细胞,G418筛选出阳性细胞。三、人溶菌酶基因在小鼠乳腺癌细胞的表达将高病毒滴度的病毒液感染小鼠乳腺癌细胞(EMT6),G418筛选出阳性细胞,通过PCR和RT-PCR进行人溶菌酶的基因组整合和转录水平的检测,确定hLYZ基因在细胞中表达的正确性。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
文献综述  9-21
  第一章转基因动物技术研究概述  9-16
    1.1 引言  9
    1.2 常用转基因技术的概述  9-13
      1.2.1 显微注射法  9-10
      1.2.2 逆转录病毒介导法  10
      1.2.3 胚胎干细胞介导法  10-11
      1.2.4 原始生殖细胞介导法  11
      1.2.5 精子介导法  11-12
      1.2.6 体细胞核移植法  12-13
    1.3 转基因动物的应用  13-14
      1.3.1 生物制药  13
      1.3.2 异种器官移植  13-14
      1.3.3 建立人类疾病的动物模型  14
      1.3.4 畜禽抗病育种和提高畜禽生产性能  14
    1.4 转基因动物技术存在的问题与展望  14-16
      1.4.1 转基因动物的成功率较低  15
      1.4.2 外源基因的整合率低、表达可控性差  15
      1.4.3 外源基因转入的细节过程及其理论不清楚  15
      1.4.4 安全性问题  15-16
  第二章人溶菌酶研究概述  16-21
    2.1 引言  16
    2.2 溶菌酶的来源及种类  16-17
      2.2.1 动物源溶菌酶  16-17
      2.2.2 植物源溶菌酶  17
      2.2.3 微生物源溶菌酶  17
    2.3 溶菌酶的理化特性  17
    2.4 人溶菌酶的药理作用  17-18
      2.4.1 抗菌消炎  17-18
      2.4.2 抗病毒  18
      2.4.3 增强免疫力  18
    2.5 人溶菌酶的应用  18
    2.6 天然人溶菌酶的提取  18
    2.7 重组人溶菌酶的制备  18-21
      2.7.1 微生物表达系统  18-19
      2.7.2 转基因生物反应器  19-21
实验部分  21-38
  第三章人溶菌酶基因乳腺特异性表达载体的构建  21-29
    3.1 材料  21-22
      3.1.1 质粒和菌株  21
      3.1.2 主要试剂  21-22
    3.2 方法  22-24
      3.2.1 EGFP 和牛β－酪蛋白基因3'调控序列的PCR 扩增  22
      3.2.2 琼脂糖凝胶电泳  22
      3.2.3 目的片段EGFP 和BBC3 的回收纯化  22
      3.2.4 目的片段的亚克隆、转化及质粒提取  22-23
      3.2.5 用内切酶酶切鉴定重组质粒  23
      3.2.6 乳腺特异性表达载体pLEBH 的构建  23-24
    3.3 结果  24-27
      3.3.1 EGFP 基因的PCR 的扩增  24
      3.3.2 BBC3 基因的PCR 的扩增  24
      3.3.3 重组质粒pMD-EGFP 与pMD-BBC3 双酶切鉴定结果  24-25
      3.3.4 质粒pLNCX2、pLE、pLEB 与pEBH 双酶切结果  25-27
      3.3.5 重组质粒pLEBH 的构建图及其鉴定  27
    3.4 讨论  27-28
    3.5 结论  28-29
  第四章牛乳腺上皮细胞的培养及其转染  29-35
    4.1 材料和方法  29-31
      4.1.1 材料  29
      4.1.2 方法  29-31
    4.2 结果  31-33
      4.2.1 牛乳腺上皮细胞原代、传代培养和冻存复苏培养结果  31-32
      4.2.2 NIH-3T3 细胞的抗性浓度及其病毒滴度的确定  32
      4.2.3 感染逆转录病毒液乳腺上皮细胞的EGFP 的表达  32-33
    4.3 讨论  33-34
    4.4 结论  34-35
  第五章人溶菌酶基因在小鼠乳腺癌细胞的表达  35-38
    5.1 材料和方法  35-36
      5.1.1 材料  35
      5.1.2 方法  35-36
    5.2 结果  36-37
      5.2.1 感染逆转录病毒液EMT6 细胞的EGFP 的表达  36
      5.2.2 Human Lysozyme 基因PCR 检测结果  36-37
      5.2.3 Human Lysozyme 基因转录水平检测结果  37
    5.3 讨论  37
    5.4 结论  37-38
参考文献  38-48
致谢  48-49
个人简介  49

逆转录病毒载体介导的人溶菌酶基因在乳腺细胞的表达

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