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活化Notch1对宫颈癌细胞增殖的影响及与NF-κB间的串话作用

作　者: 姚军
导　师: 伍欣星
学　校: 武汉大学
专　业: 病原生物学
关键词: Notch1 NF-κB 宫颈癌信号转导通路凋亡
分类号: R737.33
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

细胞的分化、发育、生长是一个复杂的过程,受到多种因素的调控。近年来,人们发现在多种组织和器官的发育过程中,Notch家族成员对细胞的发育、生长、凋亡等起重要的调控作用。然而,目前研究表明,该家族成员Notch1的信号转导在同一组织来源的肿瘤中可产生两种截然不同的作用,即促进肿瘤形成和/或抑制肿瘤细胞增殖。其最终效应的产生依赖于细胞类型及其所处的环境背景,但是其确切的作用机制仍然缺乏系统性研究。为了深入认识这一机制,本研究将宫颈癌细胞作为研究对象,重点探讨活化Notch1信号对宫颈癌细胞增殖的具体影响及其作用机制,尤其是Notch1信号如何发挥其抑癌作用的机制。本研究通过稳定转染外源性Notch1基因胞内区(intracellular domain of Notch, ICN),即组成性活化形式的Notch1(constitutively active Notch1),建立稳定表达Notch1组成性活化形式的宫颈癌细胞模型和裸鼠宫颈癌细胞移植性肿瘤模型,观察Notch1组成性活化形式的稳定表达对宫颈癌HeLa细胞体外及体内增殖、细胞周期及凋亡的影响,并进一步探讨它与另一重要的细胞信号转导通路——核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)信号转导通路之间的串话(cross-talk)作用,深入探讨Notch1信号的作用机制。本研究首先将人Notch1基因胞内区克隆至逆转录病毒表达载体pCLNRX中,采用脂质体lipofectamineTM2000将pCLNRX-ICN与包装载体pCL-10A1共转染293细胞,制备重组病毒上清,并感染NIH3T3细胞检测病毒滴度。通过携带有ICN的重组逆转录病毒载体感染宫颈癌HeLa细胞(HeLa-ICN细胞),使Notch1信号在胞内组成性活化(constitutive activation)。同时,用相同方法制备仅表达新霉素抗性基因(neomycin resistance gene,neo)的空逆转录病毒载体去感染宫颈癌HeLa细胞(HeLa-G418细胞)。这两组被感染的细胞均用含G418的培养基加压筛选出稳定表达外源基因的抗性克隆。采用MTT比色法观察了稳定表达外源性ICN——组成性活化形式的Notch1对宫颈癌HeLa细胞体外生长的影响。细胞生长曲线分析结果显示,HeLa-ICN细胞的生长明显受到抑制,而HeLa-G418细胞和空白对照细胞生长稳定。细胞增殖的抑制与细胞周期阻滞和凋亡密切相关。流式细胞仪分析细胞周期分布的变化,结果显示,与对照组相比,稳定表达外源性ICN蛋白的HeLa-ICN细胞中,G2-M期细胞增多,并伴有S期细胞减少,表明通过稳定转染外源性ICN而活化的Notch1信号可以抑制宫颈癌细胞的增殖,使细胞停滞在G2-M期。细胞的增殖和死亡与细胞周期的进程密切相关,而细胞周期主要受由细胞周期素、细胞周期素依赖性激酶和细胞周期素依赖性激酶抑制剂构成的网络调控。细胞周期素依赖性激酶1(cyclin-dependent kinase, Cdk1)活化是G2-M关卡处的关键调控因素。采用Western blot方法检测了细胞周期调控蛋白Cdk1表达水平,结果显示HeLa-ICN细胞Cdk1表达水平下调,提示Cdk1的表达下调可能参与了活化的Notch1信号诱导细胞周期阻滞的机制。各实验组细胞经Hoechst 33342染色质荧光染色后,HeLa-ICN细胞可见细胞核染色质凝集、核碎裂的凋亡细胞比例逐渐增多,明显高于转染空载体的对照组和空白对照组。本研究还采用Annexin V/PI双标记流式细胞术检测凋亡,检测结果显示,稳定表达外源性ICN的HeLa-ICN细胞凋亡率(总凋亡率约达到38.5%,以早期凋亡细胞为主)显著高于转染空载体的对照组(7.7%)和空白对照组(2.6%)。该实验结果进一步证实,活化的Notch1信号能明显诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡。以上结果表明通过稳定转染外源性ICN而活化的Notch1信号可通过诱导细胞周期阻滞和凋亡而抑制宫颈癌HeLa细胞的增殖。在建立稳定表达Notch1组成性活化形式的宫颈癌细胞模型的基础上,进一步建立了裸鼠宫颈癌细胞移植性肿瘤模型,观察肿瘤细胞体内生长情况。将三组细胞(HeLa-ICN组、HeLa-G418组和空白对照组)分别接种裸鼠后,虽然三组细胞在接种一个月后都能形成肉眼可见的肿瘤,但皮下注射HeLa-ICN细胞的裸鼠背部形成的肿瘤体积明显小于皮下注射了同等数量的HeLa-G418细胞组和空白对照细胞组。该结果表明组成性活化形式的Notch1能明显抑制肿瘤细胞在裸鼠体内的增殖。由于NF-κB信号转导通路在肿瘤发生发展的多个环节都有重要意义,尤其是在细胞凋亡中发挥着重要的作用。通过抑制NF-κB的活性,肿瘤细胞往往出现凋亡,而且在宫颈癌组织及细胞中常常出现NF-κB活性的异常增强。因此,我们应用电泳迁移率变动分析法(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)通过对NF-κB的DNA结合力进行分析而对NF-κB活性进行检测。EMSA结果显示,与空白对照细胞和HeLa-G418细胞比较,HeLa-ICN细胞的NF-κB活性被明显抑制。为了进一步证实是否确实存在NF-κB活性的抑制,以及被抑制的NF-κB的亚型,我们又进行了超级阻滞实验(supershift assay)。将HeLa-ICN细胞核提取物和抗NF-κB p50或NF-κB p65亚基的抗体共同孵育后,电泳条带上只有加入NF-κB p50抗体的样品中形成的特异性复合物(抗原抗体DNA复合物),因而,特异性复合物由于分子量相对较大被阻滞于高分子量区,提示宫颈癌HeLa细胞中NF-κB活性的抑制作用可能是通过Notch1蛋白对NF-κB p50的直接或者间接作用来实现的。我们进一步检测了Notch1信号活化对NF-κB p50在宫颈癌HeLa细胞中表达水平及分布的影响。与上述观察结果相一致的是,和空白对照细胞和HeLa-G418细胞相比较,HeLa-ICN细胞核内NF-κB p50蛋白表达水平明显下降。然而,NF-κB p50的细胞总蛋白表达水平却无明显变化。细胞免疫化学结果进一步证实了NF-κB p50的细胞核蛋白表达水平明显下降。以上结果提示,Notch1可能是部分通过抑制NF-κB p50的核移位(nuclear translocation)来实现对NF-κB活性的抑制的。IκBα(inhibitor of NF-κBα;NF-κB抑制因子α)是NF-κB的主要抑制因子,Western blot检测结果显示,HeLa-ICN细胞胞浆内IκBα的蛋白表达水平明显上升,提示NF-κB活性的抑制可能与其IκBα上调有关。已有研究表明,cyclin D1、Bcl-2和c-Myc等基因异常表达与肿瘤细胞(包括宫颈癌细胞)的凋亡和增殖相关,并且cyclin D1、Bcl-2和c-Myc都属于NF-κB信号转导通路下游的靶基因。因此,我们对三组细胞总蛋白中cyclin D1、Bcl-2和c-Myc的表达水平进行了检测,Western blot检测结果显示,在HeLa-ICN细胞中,NF-κB的两个重要靶基因——Bcl-2和cyclin D1的蛋白表达水平明显下降。然而,NF-κB的另一重要靶基因——c-Myc的蛋白表达水平未见明显的变化,提示活化的Notch1信号对c-Myc总蛋白表达水平无明显影响。综上所述,除了通过诱导细胞周期阻滞而抑制宫颈癌HeLa细胞的增殖外,本研究还显示凋亡可能参与了Notch1介导细胞生长抑制作用,并发现该抑制作用可能与Notch1与NF-κB信号转导通路之间的的串话作用有关,即Notch1信号活化诱导细胞周期阻滞和凋亡可能与其对NF-κB活性及其核移位的抑制效应有关。Notch1信号活化诱导的细胞周期阻滞、凋亡及细胞增殖抑制可能与NF-κB活性抑制以及Cdk1、cyclin D1和Bcl-2的表达下调有关。本研究结果不仅证实了活化的Notch1信号可通过调控细胞周期和凋亡而发挥对宫颈癌HeLa细胞体内和体外的增殖抑制作用,并进一步完善了Notch1信号转导机制,而且为建立一种新的宫颈癌治疗模式——以Notch1信号为靶向的肿瘤信号转导干预治疗提供实验基础和理论依据。

全文目录

一、中文摘要  7-11
二、英文摘要  11-17
三、引言  17-21
四、正文  21-77
  第一部分 Notch1 信号活化对宫颈癌细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响  21-60
    引言  21-22
    材料与方法  22-41
    结果  41-56
    讨论  56-60
  第二部分 Notch1 信号活化对宫颈癌细胞中的NF-κB 信号转导通路及相关基因的影响  60-77
    引言  60-62
    材料与方法  62-66
    结果  66-71
    讨论  71-77
五、全文结论  77-79
六、参考文献  79-90
七、综述  90-132
  正文  90-112
  参考文献  112-132
八、攻博期间发表的科研成果目录  132-133
九、后记  133

活化Notch1对宫颈癌细胞增殖的影响及与NF-κB间的串话作用

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