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蒺藜皂苷对心肌缺血的保护作用及其分子机制研究

作　者: 孙巍
导　师: 杨世杰
学　校: 吉林大学
专　业: 药理学
关键词: 蒺藜皂苷心肌缺血凋亡 PKCε ERK1/2
分类号: R285
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

中药蒺藜又称白蒺藜、刺蒺藜,系指蒺藜科植物蒺藜(Tribulus terrestris L.)的果实。主要含有皂苷类、黄酮类、生物碱类、甾醇类等化合物。本实验用蒺藜皂苷是从蒺藜地上全草中提取的有效组分之一,是以甾体皂苷为主的十多种皂苷的混合物,主要包括呋甾醇和螺甾醇两类皂苷,为黄色粉末,易溶于水。研究资料表明蒺藜皂苷具有降血压、舒张血管、降低胆固醇和抗动脉粥样硬化作用;对离体大鼠心脏缺血再灌注损伤,对体外培养的心肌细胞缺血再灌注损伤以及对急性脑缺血损伤均具有保护作用;对NaCN诱导大鼠培养心肌细胞缺氧性损伤具有保护作用;对成年豚鼠心室肌细胞缺氧性损伤具有保护作用;对大鼠结扎左冠状动脉前降支所致的心肌缺血及对H2O2诱导大鼠培养心肌细胞缺血缺氧性损伤保护作用机制与其稳定线粒体膜电位,上调Bcl-2蛋白表达和下调Bax的蛋白表达及降低[Ca2+]i,从而抑制心肌细胞凋亡有关,同时与减少缺血致细胞内钾丢失相关。但对心肌缺血性损伤保护的分子机制尚未彻底阐明。以往研究认为,受体及其他信号蛋白分子大部分都位于原地,空间的信号转移主要通过第二信使的快速扩散进行.当前研究则建立了一个完全不同的概念,即信号蛋白的定位和激活后转位,以及伴随的与其他蛋白质的可逆性结合,才是信号在细胞内进行有效传递的关键,也正是我们研究药物作用机制的关键所在。细胞外各种刺激信号通过不同的信息传递通路,共同交汇于PKC ,激活的PKC通过依赖或非依赖ras机制激活MAPK ,由此形成PKC-MAPK级联反应[1-5]。因此,研究PKC-MAPK是揭示蒺藜皂苷保护心肌细胞分子作用机制的切入点。为进一步探讨蒺藜皂苷对心肌缺血性损伤保护作用及其分子机制,本文进行了如下研究。1、建立Langendorff离体心脏缺血再灌注模型,观察蒺藜皂苷对心肌缺血大鼠心功能、心脏灌流液中SOD、MDA、CK-MB等生化指标;梗死面积变化的影响;采用TUNEL方法半定量观察蒺藜皂苷对缺血再灌注损伤致凋亡细胞阳性率的影响;并应用westernblot方法定量检测细胞膜蛋白激酶C Eplison亚型(PKCε)蛋白含量及细胞外信号调节激酶(ERK1/2)的含量变化。结果表明蒺藜皂苷可明显改善心功能、降低心脏灌流液中MDA、CK-MB含量,升高SOD水平。减少心肌梗死面积,降低心肌细胞凋亡率。能够促进PKCε由细胞浆转位到细胞膜上,并且增加心肌组织中ERK1/2含量的表达。应用PKCε抑制剂Chelerythrine预处理后,蒺藜皂苷上述保护作用被部分阻断,并且Chelerythrine可抑制ERK1/2的表达,说明PKCε与ERK1/2在信号传导通路中存在上下游关系。2、建立H2O2诱导大鼠乳鼠心肌细胞缺氧性损伤模型, MTT法测定GSTT对受损心肌细胞存活力的影响以及采用流式细胞术观察蒺藜皂苷对缺氧致心肌细胞凋亡百分率;荧光显微镜观察Hoechst33258染色凋亡心肌细胞形态;激光共聚焦显微系统观察细胞内钙超载及细胞内PKCε含量的变化;Western blot分析蒺藜皂苷对H2O2诱导心肌细胞内PKCε、ERK1/2、Bcl-2/Bax、磷酸化PKCε、ERK1/2的表达;激光共聚焦显微系统观察蒺藜皂苷对缺氧心肌细胞内ERK1/2核转位的情况;RT-PCR方法检测Bcl-2/Bax mRNA的表达。结果表明,蒺藜皂苷可提高受损细胞存活率,降低细胞凋亡百分率,降低细胞内钙超载,上调Bcl-2下调Bax蛋白及mRNA表达;上调磷酸化PKCε、ERK1/2的表达,促进ERK1/2由细胞浆转位至细胞核内参与核内蛋白调节等。应用PKCε抑制剂Chelerythrine预处理后,蒺藜皂苷上述保护作用被部分阻断,并且Chelerythrine可抑制ERK1/2的表达,说明蒺藜皂苷可能通过激活PKCε-ERK1/2信号传导通路而抑制心肌细胞凋亡,从而发挥其保护作用。

全文目录

提要  4-8
英文缩写词表  8-10
引言  10-11
第一篇文献综述  11-34
  第一章心肌缺血病理生理学改变及心肌损伤机制  11-13
  第二章心肌缺血的药物治疗  13-16
  第三章心肌细胞凋亡及其信号传导通路  16-19
  第四章心肌细胞内蛋白激酶 C 信号传导通路  19-25
  第五章蛋白激酶C 与其他心血管疾病  25-30
  第六章蒺藜皂苷在心脑血管方面的研究进展  30-34
第二篇实验研究  34-84
  第一章蒺藜皂苷对大鼠 Langendorff 离体心脏灌流模型造成缺血再灌注损伤的保护作用  34-48
    第一节材料与方法  34-40
      一、实验材料  34-35
      二、实验方法  35-40
    第二节实验结果  40-48
      一、蒺藜皂苷对缺血再灌注后心功能的影响  40-41
      二、蒺藜皂苷对缺血再灌注心肌酶学的影响  41
      三、蒺藜皂苷对心肌组织中SOD、MDA 含量的影响  41-43
      四、蒺藜皂苷对缺血再灌注心肌缺血面积的影响  43-44
      五、蒺藜皂苷对缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响  44
      六、蒺藜皂苷对缺血再灌注心肌组织内 PKCε磷酸化及其转位的影响  44-46
      七、蒺藜皂苷对缺血再灌注心肌组织内 ERK1/2 磷酸化的影响  46-48
  第二章蒺藜皂苷对 H_2O_2诱导培养大鼠乳鼠心肌细胞缺氧损伤保护作用  48-84
    第一节材料与方法  48-59
      一、实验材料  48-49
      二、实验方法  49-59
    第二节实验结果  59-76
      一、细胞形态学观察  59-60
      二、Hoechst33258 检测凋亡细胞形态  60
      三、蒺藜皂苷对心肌细胞存活率的影响  60-62
      四、蒺藜皂苷对心肌细胞内游离钙离子浓度的影响  62-64
      五、蒺藜皂苷对心肌细胞凋亡率的影响  64-65
      六、蒺藜皂苷对心肌细胞内 PKCε含量的影响  65-66
      七、蒺藜皂苷对心肌细胞内 PKCε、ERK1/2 含量的影响  66-70
        1. 蒺藜皂苷不同作用时间对心肌细胞内 PKCε表达及活性的影响  66-67
        2. 抑制剂对蒺藜皂苷增加 PKCε含量及活性的影响  67-68
        3. 蒺藜皂苷不同作用时间对 ERK1/2 含量及活性的影响  68-69
        4. 抑制剂对蒺藜皂苷增加 ERK1/2 含量及活性的影响  69-70
      八、蒺藜皂苷对心肌细胞内 ERK1/2 核转位的影响  70-72
      九、蒺藜皂苷对 Bcl-2/Bax 蛋白含量的影响  72-74
      十、蒺藜皂苷对心肌细胞Bcl-2 和Bax mRNA 含量的影响  74-76
    第三节讨论  76-84
结论  84-86
参考文献  86-99
攻读博士学位期间发表的学术论文  99-100
中文摘要  100-104
英文摘要  104-109
致谢  109

蒺藜皂苷对心肌缺血的保护作用及其分子机制研究

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