学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

重组人血清白蛋白—干扰素α 2b融合蛋白的研究

作　者: 黄岩山
导　师: 陈智
学　校: 浙江大学
专　业: 内科学
关键词: 重组人血清白蛋白干扰素α融合蛋白毕赤酵母发酵纯化鉴定药物动力学药效动力学免疫原性
分类号: R91
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
下　载: 557次
引　用: 1次
阅　读: 论文下载

内容摘要

研究目的：利用人血清白蛋白融合技术，制备一种在体内半衰期长，生物学活性高的长效研究重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白，用于病毒性肝炎，肿瘤等相关疾病的治疗。研究方法：1．重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白（rHSA/IFNα2b）酵母高表达菌株的构建，包括人血清白蛋白融合和干扰素α2b基因的获得，重组表达质粒的构建，毕赤酵母表达菌株的转化，筛选。2．重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白酵母高表达菌株发酵培养条件的优化。3．毕赤酵母表达重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白纯化方法的研究。4．通过SDS-PAGE，等电聚焦，蛋白质杂交，氨基酸末端序列分析，质谱分析，肽谱，圆二色谱（CD）以及体外生物活性等方法对毕赤酵母表达的rHSA/IFNα2b进行结构鉴定。5．在食蟹猴体内进行药物动力学及药效动力学研究，检测动物体内rHSA/IFNα2b后血清浓度随时间变化情况以及血清2′，5′-寡腺苷酸合成酶（2′，5′-OAS）的变化，并与普通IFNα2b进行比较。并研究多次给药后rHSA/IFNα2b的免疫原性情况。结果：1．通过PCR技术从文库中分别扩增HSA和IFN的cDNA，克隆到毕赤酵母表达载体pGENYD2中，获得含有HSA和IFN编码序列的重组质粒pGENYD2-HSA/IFNα2b，转化甲醇酵母受体菌GS115，筛选获得稳定整合、稳定表达rHSA/IFNα2b的毕赤酵母工程菌，表达形式为分泌型，摇瓶表达量大于50mg/L。2．对影响重组毕赤酵母Pichia pastoris表达rHSA/IFNα2b的主要参数进行了摇瓶发酵试验，并根据摇瓶发酵的结果指导补料分批高密度发酵。最终确定控制甲醇浓度在0.5％之内，诱导pH5.0，温度22℃，添加0.1％吐温-80和有机培养基，发酵周期为96h对融合蛋白的发酵最优条件。在该条件下表达量最高达432mg/L。。3．发酵液上清超滤浓缩，通过亲和柱层析、疏水柱层析、离子交换柱层析和凝胶柱层析组合纯化，纯化所得的rHSA/IFNα2b的纯度达98％以上，蛋白回收率约为25％。4．rHSA/IFNα2b分子量为86KD，等电点为5.3，N端15个氨基酸序列及C端3个氨基酸序列与理论推测一致，产物的相对分子质量为86593.2±20.5，质量肽谱与理论序列的重叠率为75％，体外生物活性大于5.0×10⁵IU/mg。5．rHSA/IFNα2b药物代谢动力学及药效动力学研究显示，rHSA/IFNα2b皮下给药后，半衰期（t1/2）长达92小时，与IFNα-2b相比，其中t_1/2平均延长了19.6倍。6．药物动力学研究显示，在单次注射rHSA/IFNα2b后，2′，5′-OAS表达显著增加而且呈量效关系，而且2′，5′-OAS活性在体内维持长达14天，相比之下，IFNα诱生的2′，5′-OAS不仅强度低，而且维持的时间也很短。7．免疫原性实验研究发现，给药2周开始，给药动物体内产生了抗rHSA/IFNα2b抗体，并且8周时监测抗体具有中和干扰素活性作用。结论：1．rHSA/IFNα2b融合蛋白在毕赤酵母系统中得到了高效表达，罐上表达量大于400mg/L。表达产物经多种物理，化学和生物学方法研究证明结构正确，样品制备工艺切实可行，纯化总体收率＞20％，最终产品质量符合临床研究要求。2．食蟹猴体内进行药物动力学及药效动力学研究表明，rHSA/IFNa2b在动物体内有效的延长了半衰期，并且对诱生与IFN活性相关的2′，5′-OAS酶活性的能力显著提高，但是在食蟹猴体内有一定的免疫原性。3．现有的研究表明，酵母表达的rHSA/IFNa2b不仅显著延长了半衰期，而且体内活性更高。因此同普通IPNa相比，临床给药频率可以延长到每两周甚至每月一次，既减少了血药浓度波动，也提高了病人依从性，从而带来更好的临床治疗效果。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-9
研究背景  9-13
  1.新型制剂  9
  2.蛋白质工程改造技术  9
  3.蛋白质的PEG修饰  9-10
  4.融合蛋白技术  10-13
第一章 rHSA/IFNα2b毕赤酵母高表达菌株的构建  13-33
  1.引言  13
  2.实验材料  13-15
  3.方法  15-18
  4.结果  18-30
  5.讨论  30-32
  参考文献:  32-33
第二章毕赤酵母表达rHSA/IFNα2b融合蛋白发酵工艺研究  33-42
  1.前言  33
  2.实验材料  33-34
  3.实验方法  34
  4.结果与讨论  34-41
  参考文献:  41-42
第三章重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的表达和纯化  42-52
  1.前言  42
  2.材料与方法  42-44
  3.结果与讨论  44-51
  参考文献:  51-52
第四章毕赤酵母表达rHSA/IFNα2b融合蛋白的结构分析与鉴定  52-63
  1.前言  52-53
  2.材料与方法  53-55
  3.结果  55-59
  4.讨论  59-61
  参考文献:  61-63
第五章 rHSA/IFNα2b融合蛋白药物代谢动力学及药效动力学研究  63-89
  1.前言  63
  2.实验材料与方法  63-66
  3.结果与讨论  66-86
  4.结论  86-87
  参考文献:  87-89
研究结论  89-90
本研究存在的问题及后续的研究计划  90-91
发表论文  91-99
综述长效IFN-α制备及其在病毒性肝炎治疗中的应用  99-126
附录  126-127
致谢  127

重组人血清白蛋白—干扰素α 2b融合蛋白的研究

内容摘要

全文目录

相似论文