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林蛙嗜水气单胞菌气溶素基因原核表达及免疫原性的初步分析

作　者: 白雪梅
导　师: 李太元
学　校: 延边大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 林蛙 嗜水气单胞菌 气溶素基因 原核表达 免疫原性
分类号: S947.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 22次
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内容摘要


林蛙“红腿病”是危害林蛙养殖业的主要疾病之一,该病传播快、死亡率高,对林蛙的养殖业的危害严重。嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila, AH)是林蛙“红腿病”的主要致病菌。该菌的致病力与毒力因子关系密切,尤其是气溶素(Aer)。气溶素由463个氨基酸组成,分子质量为51.5 ku,是嗜水气单胞菌主要的毒力因子之一,具有溶血性、细胞毒性和肠毒性。该菌的血清型多,在不同的地区、不同的宿主都有所差异,这对灭活苗的使用造成了很大的限制。找出不同血清型菌株共同的保护性抗原,研制出新型亚单位疫苗是现在研究的迫切需求。本试验根据GenBank上报道的嗜水气单胞菌气溶素基因序列(NCBI登录号：DQ186611),针对该基因的保守区,设计了一对扩增气溶素基因的特异性引物,以从林蛙体内分离的嗜水气单胞菌基因组DNA为模版,用PCR方法扩增目的片段,将该基因克隆pMD18-T载体上,经PCR、酶切及序列测定的鉴定和分析,结果表明成功地克隆了1163 bp的林蛙嗜水气单胞菌气溶素基因,对所克隆的气溶素基因序列与基因库中已发表的DQ186611进行比较分析同源性高达99%。再将该基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-1上,经PCR鉴定及酶切鉴定,证明成功地构建了原核表达载体pGEX-Aer。将构建好的原核表达载体,经1 mmol/L的IPTG诱导,在大肠杆菌BL21中进行表达,经过8 h表达量达到最高。该融合蛋白pGEX-Aer的分子量约为69 ku,表达蛋白主要以包涵体形式存在。经Western blotting免疫印记分析,该融合蛋白具有较好的反应原性。将表达蛋白经亲和层析纯化后免疫小鼠,.应用间接ELISA和淋巴细胞增殖试验(MTr)来检测体液免疫和细胞免疫水平。结果表明,表达蛋白能够刺激机体产生较好的体液免疫及细胞免疫水平。证明该融合蛋白具有较好的抗原性,为林蛙嗜水气单胞菌疫苗的研制提供了前期工作。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-12
前言  12-20
  1 嗜水气单胞菌概述  12
  2 嗜水气单胞菌对林蛙养殖业的危害及防治  12-13
    2.1 临床症状及病理变化  12-13
    2.2 防治  13
  3 嗜水气单胞菌的诊断  13-15
    3.1 细菌学诊断  13
    3.2 聚合酶链式反应  13
    3.3 间接荧光抗体技术  13-14
    3.4 酶联免疫吸附试验  14
    3.5 环节导等温扩增检测技术  14
    3.6 单克隆抗体技术  14-15
    3.7 胶体金诊断技术  15
  4 嗜水气单胞菌疫苗的研究  15-17
    4.1 灭活苗  15-16
    4.2 活菌疫苗  16
    4.3 基因工程苗  16-17
    4.4 口服疫苗  17
  5 嗜水气单胞菌的气溶素基因  17-18
    5.1 概述  17-18
    5.2 性质  18
    5.3 气溶素的致病性  18
  6 本研究的目的及意义  18-20
材料与方法  20-32
  1 材料  20-23
    1.1 菌种  20
    1.2 试剂及工具酶  20
    1.3 主要仪器  20-21
    1.4 试验所用主要试剂及培养基的配制  21-23
  2 方法  23-32
    2.1 嗜水气单胞菌的培养  23
    2.2 DNA的提取  23-24
    2.3 感受态细胞的制备  24
    2.4 引物的设计与合成  24
    2.5 目的基因Aer的PCR扩增  24-25
    2.6 PCR产物的纯化与回收  25
    2.7 目的基因Aer的克隆与鉴定  25-26
    2.8 Aer基因原核表达载体的构建与鉴定  26-27
    2.9 重组表达质粒的诱导表达  27
    2.10 表达产物的SDS-PAGE分析  27-28
    2.11 表达产物的Western blotting分析  28
    2.12 表达蛋白的纯化  28-29
    2.13 纯化蛋白浓度的测定  29
    2.14 动物免疫前准备  29
    2.15 动物分组及免疫接种  29-30
    2.16 免疫小鼠血清ELISA抗体水平的检测  30
    2.17 免疫小鼠细胞免疫水平的初步检测  30-31
    2.18 数据处理  31-32
结果  32-42
  1 目的基因Aer的PCR扩增  32
  2 重组克隆质粒pMD18-T-Aer的PCR及酶切鉴定  32-35
  3 Aer基因原核表达的鉴定  35-38
    3.1 重组质粒pGEX-Aer的PCR及酶切鉴定  35-36
    3.2 pGEX-Aer的序列测定  36-38
  4 重组表达质粒pGEX-Aer的诱导表达  38
  5 融合蛋白的Western blotting分析  38-39
  6 融合蛋白的纯化及浓度测定  39-40
  7 免疫小鼠血清的ELISA抗体检测结果  40-42
    7.1 各免疫组小鼠抗体水平的检测  40-41
    7.2 小鼠T淋巴细胞增殖试验结果  41-42
讨论  42-44
  1. 蛋白的纯化  42
  2 抗嗜水气单胞菌pGEX-Aer融合蛋白多抗的制备  42-43
  3. MTT法检测淋巴细胞的增殖水平  43-44
结论  44-45
参考文献  45-50
致谢  50-51
作者简介  51-52
附录  52

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 其他水产病虫害及其防治 > 蛙病及其防治
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