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嵌合抗CD20抗体突变体的表达及其作用机理的研究

作　者: 刘银星
导　师: 杨纯正；朱祯平
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 药理学
关键词: CD20 嵌合抗CD20抗体突变B淋巴瘤凋亡
分类号: R392
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

近年来，抗体疗法在肿瘤临床受到越来越多的关注，尤其以CD20为靶点治疗非霍杰金氏淋巴瘤的单克隆抗体（包括放射性标记的抗体）在临床已经取得了令人瞩目的成功。目前，美国FDA已正式批准上市的抗CD20抗体有Rituximab（Rituxan（?）），Bexxar^TM和Zevalin^TM，这说明抗CD20抗体在临床应用具有较好的安全性。尽管抗CD20抗体在临床治疗非何杰金氏淋巴瘤上获得了成功，但是其抑制肿瘤的作用机理仍有一定的争议，还需进一步深入研究。我们开发了具有我国知识产权的新的抗CD20抗体HI47及其嵌合片段。本文主要目的是研究一突变的抗CD20抗体克隆，研究抗CD20抗体的体外生物学活性以及为了增加抗体杀伤肿瘤的效率，构建可以在真核细胞CHO中表达的完整嵌合抗CD20抗体分子。本文利用噬菌体显示技术成功地从H147杂交瘤细胞中克隆单克隆抗CD20抗体HI47的轻重链可变区基因，构建成抗CD20单链抗体的表达载体pCANTAB 5E CD20ScFv，发现有克隆（-7）的轻链26位氨基酸为Asn，而其它克隆（-2）轻链26位氨基酸均为Ser。利用基因工程的方法，将两种克隆分别构建成嵌合抗CD20抗体Fab′片段（CD20-7和CD20-2），并在大肠杆菌16c9中表达。从抗CD20单链抗体表达载体pCANTAB 5E CD20ScFv上扩增抗CD20抗体轻、重链可变区基因VL和VH，将VL、VH基因通过分别含有人IgG1 CL和CH1的中间载体sspB11和sspB12，构建成抗CD20嵌合抗体片段Fab′表达载体pYZFcd20。CD20-7的产量和活性均高于CD20-2，CD20-7表达量为6.8 mg／L，CD20-2表达量的3倍。CD20-7和CD20-2亲和力常数Ka分别约为2.2×10⁹M^-1和1×10⁹M^-1。免疫荧光抑制实验表明，同等摩尔量的CD20-7和CD20-2能竞争性抑制鼠源性抗CD20抗体HI47和CD20表达阳性的Raji细胞的结合，分别使HI47的结合阳性率由98％下降至38％和71％。MTT法测定的体外Raji细胞生长抑制试验表明二者均以剂量依赖的方式抑制细胞生长，CD20-7和CD20-2的IC50值分别约为29.5和63.7μg／ml。以上说明轻链的S26N对抗体片段Fab′的较高水平的表达和生物活性的提高有一定的贡献。由于Fab′易形成多聚体，在生物活性实验中用基因工程抗体片段Fab代替Fab′。研究表明，HI47及其嵌合抗体Fab和F（ab′）₂片段(轻链带有S26N

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-9
前言  9-12
实验部分  12-63
  一、抗CD20嵌合抗体突变体Fab′片段的构建与表达  12-33
    1、实验材料与方法  12-26
    2、实验结果  26-33
  二、抗CD20抗体对B淋巴细胞的生物学作用  33-50
    1、实验材料与方法  33-39
    2、实验结果  39-50
  三、抗CD20抗体全分子表达载体的构建与表达  50-63
    1、实验材料与方法  50-57
    2、实验结果  57-63
讨论  63-75
结论  75-76
参考文献  76-81
附录一、缩写词表  81-84
附录二、培养基及溶液  84-86
论文综述  86-114
致谢  114-115

嵌合抗CD20抗体突变体的表达及其作用机理的研究

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