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小鼠骨骼肌细胞SelW基因的RNA干扰研究

作　者: 王晓龙
导　师: 华育平
学　校: 东北林业大学
专　业: 野生动植物保护与利用
关键词: 骨骼肌细胞 Selenoprotein W RNA干扰定量PCR FCM
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

Selenoprotein W(SelW)蛋白在所有含硒蛋白中是发现得较晚的一个,虽有间接证据证明其在代谢过程中的角色与骨骼肌健康密切相关,但是尚未有支持这一论断的直接实验证据。牛、羊、猴、人类和啮齿类组织中的Selenoprotein W都对食物中硒的水平敏感,并主要积聚于骨骼肌;其结构特点与其在缺硒状态肌肉组织中无法检测到的事实都显示其和硒缺乏性骨骼肌病变之间有着密切的关系而值得研究。因此定性、定量地考察Selenoprotein W的作用,有利于分析其对于骨骼肌细胞代谢的重要意义。同时,通过检测Selenoprotein W定性、定量下调后细胞产生的变化,可以准确反应目标蛋白与骨骼肌细胞健康之间的关系,模拟白肌病的临床病理过程。本研究中Selenoprotein W mRNA和蛋白的下调采用RNA干扰技术,首先根据目的mRNA翻译区序列合成了21bp长的,具有特殊结构要求的双链siRNA,参照文献记载,选取对小鼠骨骼肌细胞转染效率较高的阳离子脂质体Lipofactamine为转染试剂,使其与合成的siRNA形成复合体,利用胞饮和范德华力作用机理,将复合体导入小鼠骨骼肌细胞;当复合体成功进入细胞后,利用细胞所特有的机制,与细胞内特殊蛋白形成沉默复合物,发挥剪切作用,达到降解目标mRNA的目的。随后,利用蛋白印记和荧光实时定量PCR技术对细胞模型中的目标基因及其表达蛋白的动力学变化进行研究,细胞状态的变化由流式细胞术进行测量。转染效率通过转染荧光标记的与目标序列无同源性的siRNA进行报告。本研究平行地在原代细胞和传代细胞进行。在针对C2C12细胞系中SelW基因的RNA干扰实验中,最高的干扰效率见于转染后24小时,本实验的转染效率为50%至70%。在阳性小RNA效能比较实验中,选取生物学特性稳定的传代细胞作为实验材料,实验用细胞依转染不同的两个合成的siRNA分为组1,组2,并按转染试剂推荐的常规剂量,分别转染1ug小RNA。24小时和48小时后分别进行流式细胞术检测。在剂量反应检测实验中,选取实验证明具有良好效果的1号siRNA进行实验,将肌细胞分为6组,分别对应6个梯度进行实验,以便依次梯度降低SelW mRNA水平,考察针对小鼠骨骼肌细胞的合适转染剂量。每组依次转染2ug,1.5ug,1.2ug,1ug,0.5ug,0.25ug siRNA,各组依次按1～6编号。24小时后分别进行检测。在2个合成siRNA干扰效能比较实验的基础上,在实验确定了小鼠肌细胞最适的siRNA转染剂量后,进行了干扰效率检测实验,实验设立阳性组、阴性组和空白对照组3组,分别转染1号阳性siRNA、阴性siRNA(各1ug)和不转染siRNA(不转染任何外来物质仅进行培养基更换)。上述所有实验都进行后续检测,包括:流式细胞术、定量PCR和Western blot,分别针对实验用细胞状态、目的基因和蛋白的变化。结果:

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-16
1 绪论  16-26
  1.1 课题背景与意义  16-19
    1.1.1 危害严重影响广泛  16-17
    1.1.2 病理机制仍无确论  17-18
    1.1.3 研究热点引人关注  18
    1.1.4 面临问题需要解决  18-19
  1.2 国内外研究概况  19-25
    1.2.1 SelW的分离鉴定  19-20
    1.2.2 SelW的组织分布  20-21
    1.2.3 SelW的基因结构  21-22
    1.2.4 食物硒的调控作用  22-23
    1.2.5 SelW蛋白质组学  23-24
    1.2.6 SelW功能的研究  24-25
  1.3 本课题来源与主要研究内容  25-26
    1.3.1 本课题来源  25
    1.3.2 主要研究内容  25-26
2 小鼠骨骼肌细胞的培养  26-38
  2.1 实验材料  26-29
    2.1.1 仪器设备及辅助材料  26-27
    2.1.2 试剂  27
    2.1.3 试剂的配制  27-29
  2.2 实验方法  29-34
    2.2.1 小鼠骨骼肌细胞的原代培养  29-31
    2.2.2 骨骼肌细胞的选择性纯化  31-32
    2.2.3 骨骼肌细胞的克隆化培养  32
    2.2.4 控制融合  32-33
    2.2.5 小鼠骨骼肌细胞系的培养  33
    2.2.6 细胞的冻存和复苏  33-34
  2.3 结果  34-36
    2.3.1 培养细胞的观察  34-35
    2.3.2 融合控制的结果  35-36
  2.4 本章小结  36-38
    2.4.1 消化试剂的选择使用  36
    2.4.2 原代骨骼肌细胞的纯化  36
    2.4.3 提高细胞接种率的探讨  36
    2.4.4 肌肉细胞培养的具体困难  36-38
3 RNA干扰研究  38-48
  3.1 实验材料  38-39
    3.1.1 仪器设备  38-39
    3.1.2 试剂  39
    3.1.3 试剂的配制  39
  3.2 实验方法  39-45
    3.2.1 小RNA的设计与合成  39-41
    3.2.2 细胞的准备  41
    3.2.3 转染试剂的准备  41-42
    3.2.4 转染步骤  42-44
    3.2.5 转染效率检测  44-45
  3.3 结果  45-46
    3.3.1 过量siRNA导致细胞毒性  45
    3.3.2 转染效率符合实验需要  45-46
  3.4 本章小结  46-48
    3.4.1 细胞死亡原因探析  46
    3.4.2 实验材料的控制  46-47
    3.4.3 强化操作规范  47
    3.4.4 优化转染条件  47-48
4 流式细胞术对凋亡的检测  48-62
  4.1 实验材料  49
    4.1.1 仪器设备  49
    4.1.2 试剂  49
    4.1.3 试剂的配制  49
  4.2 实验方法  49-55
    4.2.1 凋亡的形态学观察  49-51
    4.2.2 流式细胞术对凋亡的检测  51-55
  4.3 结果  55-60
    4.3.1 两对合成siRNA作用效能比较  55-56
    4.3.2 剂量反应实验  56-59
    4.3.3 干扰效率测定及实验干预对细胞状态影响的评价  59-60
    4.3.4 机械损伤对检测影响的评估  60
  4.4 本章小节  60-62
    4.4.1 检测的质量控制  60
    4.4.2 不同方法检测凋亡结果的相关性  60-62
5 目的基因的定量检测  62-83
  5.1 实验材料  63-65
    5.1.1 仪器设备  63
    5.1.2 试剂  63-64
    5.1.3 试剂的配制  64-65
  5.2 实验方法  65-79
    5.2.1 引物的设计  65-67
    5.2.2 标准品的制备和鉴定  67-74
    5.2.3 SelW的定量检测  74-79
  5.3 结果  79-81
    5.3.1 剂量反应实验结果  79-80
    5.3.2 RNA干扰效率检测实验  80-81
  5.4 本章小节  81-83
    5.4.1 提高实验质量的若干措施  81-82
    5.4.2 定量扩增中的具体问题  82-83
6 SelW蛋白含量的定量检测  83-97
  6.1 实验材料  83-86
    6.1.1 仪器设备  83-84
    6.1.2 试剂  84
    6.1.3 溶液的配制  84-86
  6.2 实验方法  86-94
    6.2.1 细胞总蛋白质的制备与浓度测定  86-87
    6.2.2 SDS-PAGE电泳  87
    6.2.3 转移  87-88
    6.2.4 兔抗Se1w多克隆抗体的制备  88-92
    6.2.5 与抗体的结合  92-93
    6.2.6 显影  93-94
  6.3 结果  94-95
    6.3.1 剂量反应实验结果  94-95
    6.3.2 干扰效率实验结果  95
  6.4 本章小节  95-97
    6.4.1 非特异性问题与定量准确性问题  95
    6.4.2 抗体的选择使用  95-97
结论  97-98
参考文献  98-108
附录  108-110
攻读学位期间发表的学术论文  110-111
致谢  111-112
独创性声明  112
学位论文版权使用授权书  112

小鼠骨骼肌细胞SelW基因的RNA干扰研究

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