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苹果Ca²⁺/H⁺反向转运体活性及其基因表达特性研究

作　者: 周绚
导　师: 章镇
学　校: 南京农业大学
专　业: 果树学
关键词: 苹果 Ca2+/H+反向转运体质膜液泡膜荧光定量PCR MdCAX1
分类号: S661.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

苹果是我国的重要果树,钙对苹果生长、果实品质、贮运性等方面具有重要的影响。苹果果实缺钙可导致苦痘病、水心病和痘斑病等成熟期和贮藏期间生理性病害。研究苹果钙生理,以前在形态学、细胞学方面研究较多,本论文分别从幼果期苹果果实和叶片的钙含量；质膜和液泡膜上Ca2+/H+反向转运体活性变化；成熟果实浸钙处理后Ca2+/H+反向转运体活性变化；MdCAX1基因在八棱海棠组培苗不同组织中的表达特性等进行研究,以期为苹果的品质改良提供基础。1.以七年生“长富六号”苹果(Malus domestica Borkh’Nagafu 6’)为试材,研究幼果期果实和叶片的钙含量变化,及采后浸钙对果实不同部位的钙含量变化。研究表明幼果期叶片中的钙浓度随时间呈递增趋势。与叶片相反,果实的钙浓度呈递减趋势,呈反“J”型曲线,且叶片中的钙浓度明显高于果实。成熟采摘后果实中,种子的钙浓度最高,其次为果皮,果肉和果心中钙浓度最低,各组织之间差异都达到显著水平。经2%的CaCl2溶液浸泡15分钟后,种子和果皮的钙浓度在Duncan氏测验P=0.05水平显著增加,果肉和果心没有显著增加,但各组织之间差异仍达到显著水平。2.以七年生“长富六号”苹果为试材,研究幼果期苹果质膜和液泡膜的Ca2+/H+反向转运体活性。用两相法分离提纯了苹果果实、叶片的质膜,用蔗糖密度梯度法分离提纯了液泡膜。质膜纯度达到80%以上,液泡膜纯度达到40%,均符合生理生化分析要求。同位素闪烁记数法检测苹果质膜和液泡膜上45Ca2+转运。结果表明,幼果期果实质膜Ca2+/H+反向转运体活性呈上升趋势,在盛花后两个月左右达到最高；叶片质膜Ca2+/H+反向转运体活性在开花后一周左右活性最大,后期呈先降低后上升趋势；果实和叶片液泡膜上的Ca2+/H+反向转运体活性呈先上升后降低趋势,在盛花后一个月左右达到最高,此时果实液泡膜上的Ca2+/H+反向转运体活性是叶片的4倍左右。3.以成熟“长富六号”苹果果实为材料,浸钙(0.5% CaCl2)处理后研究不同组织中Ca2+/H+反向转运体活性。结果表明：质膜上的Ca2+/H+反向转运体活性在种子中最高,其次为果心、果皮和果肉中最低,各组织之间P=0.05水平差异达到显著。经浸钙处理后,种子和果皮的Ca2+/H+反向转运体活性明显增加。而果肉却下降。而果实液泡膜Ca2+/H+反向转运体活性在果皮中最高,其次为种子、果肉,果心最低,各组织之间差异达到显著。经浸钙处理后,各组织的活性都明显下降。4.实验以八棱海棠(Malus robusta Rehd)组培苗为材料,分别用0%、0.5%、1.2%(g/v)的CaCl2处理,通过荧光定量PCR技术研究在高钙和低钙条件下,MdCAX1基因的表达情况。结果表明：经0%CaCl2处理,根系中MdCAX1的mRNA的表达在整个处理过程几乎不表达,茎、叶在处理三天时最高；至处理七天,MdCAX1表达量逐渐降低。经0.5%CaCl2处理一天,诱导茎、叶中的MdCAX1大量表达。随着处理时间的增加,MdCAX1表达逐渐减少,至处理七天,诱导MdCAX1表达量重新增加。整个0.5% CaCl2处理过程根系中的MdCAX1表达量都很低。1.2%CaCl2处理的根系中的MdCAX1的表达在前期处理几乎不表达,而在处理十二天时达到最高。茎中的的MdCAX1的表达在处理一天后几乎不表达,处理七天表达量达到最高；至12天,表达量逐渐减少。叶片中的MdCAX1的表达在处理一天后几乎也不表达,处理三天时达到最高；至处理七天时,逐渐减少；至处理十二天时又逐渐增加。茎在处理七天时表达量最高,叶片在处理三天时表达量最高。后期可能由于液态培养液中钙浓度减少的原因,重新诱导MdCAX1的表达增加。

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中文摘要 6-8ABSTRACT 8-10缩略词 10-11引言 11-13第一章文献综述 13-29 1 植物的钙吸收及转运机制 13-16 1.1 植物钙素吸收 13 1.2 植物钙素转运机制 13-15 1.3 植物细胞质膜和液泡膜上的钙转移系统及特性 15-16 2 植物细胞对钙的运输 16-23 2.1 胞质Ca主动运输系统:Ca~(2+)-ATPase和Ca~(2+)/H~+反向转运体 18-20 2.1.1 Ca~(2+)-ATPase 18 2.1.2 Ca~(2+)/H~+反向转运体 18-20 2.2 Ca~(2+)进入胞质的被动运输系统:Ca~(2+)通道 20-23 2.2.1 细胞质膜上Ca~(2+)通道 20-21 2.2.2 液泡膜上Ca~(2+)通道 21-23 3 钙的信使作用 23-24 4 实时荧光定量技术及其在基因表达定量分析研究中的应用 24-27 4.1 实时荧光定量PCR技术基本原理 24-26 4.2 实时荧光定量PCR相对定量数据分析 26 4.3 实时荧光定量PCR技术的应用现状 26-27 5 本研究的目的和意义 27-29第二章苹果幼果期及采后浸钙处理后的钙含量变化 29-33 1 材料与方法 29-30 1.1 材料与试剂 29-30 1.2 方法 30 1.3 数据分析 30 2 结果与分析 30-32 2.1 幼果期叶片和果实中钙含量的变化 30-31 2.2 浸钙后果实不同部位的钙含量变化 31-32 3 讨论 32-33第三章幼果期苹果果实与叶片的Ca~(2+)/H~+反向转运体活性的变化 33-39 1 材料与方法 33-35 1.1 材料 33-34 1.1.1 植物材料 33 1.1.2 试剂 33-34 1.2 方法 34-35 1.2.1 质膜和液泡膜的提取 34 1.2.2 膜纯度验证 34-35 1.2.3 蛋白含量测定 35 1.2.4 钙转运测定 35 1.2.5 数据分析 35 2 结果与分析 35-37 2.1 质膜和液泡膜的纯度 35-36 2.2 幼果期叶片与果实质膜和液泡膜上的Ca~(2+)/H~+反向转运体活性比较 36-37 3 讨论 37-39第四章浸钙对苹果果实不同组织中质膜和液泡膜Ca~(2+)/H~+反向转运体活性的影响 39-43 1 材料与方法 39-40 1.1 材料 39 1.2 方法 39-40 1.2.1 质膜和液泡膜的提取 39 1.2.2 纯度验证 39-40 1.2.3 蛋白含量测定 40 1.2.4 钙转运测定 40 1.2.5 数据分析 40 2 结果与分析 40-41 2.1 浸钙苹果不同组织中质膜和液泡膜的Ca~(2+)/H~+反向转运体活性 40-41 3 讨论 41-43第五章钙处理对八棱海棠组培苗MdCAX1表达的影响 43-53 1 材料与方法 44-47 1.1 材料 44 1.2 方法 44-47 1.2.1 RNA提取药剂的配制和器皿的处理 44 1.2.2 总RNA的提取 44-45 1.2.3 总RNA中DNA的消化 45-46 1.2.4 cDNA合成和RT-PCR 46-47 1.2.5 实时荧光定量PCR条件的优化 47 1.2.6 实时荧光PCR看家基因和MdCAX1基因的引物设计与合成 47 2 结果与分析 47-51 2.1 苹果八棱海棠组培苗不同组织的总RNA的提取 47-48 2.2 SYBR Green荧光定量PCR反应退火温度的优化 48-49 2.3 缺钙处理苹果八棱海棠组培苗不同组织中Ca~(2+)/H~+反向转运体基因相对表达分析 49-50 2.4 0.5%钙处理苹果八棱海棠组培苗不同组织中Ca~(2+)/H~+反向转运体基因相对表达分析 50-51 2.5 1.2%钙处理苹果八棱海棠组培苗不同组织中Ca~(2+)/H~+反向转运体基因相对表达分析 51 3 讨论 51-53 3.1 MdCAX1基因在不同时期、不同钙浓度处理、不同组织的表达差异 51-53全文结论 53-55创新点 55-57参考文献 57-63附录 63-69攻读硕士期间发表的论文 69-71致谢 71

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