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茶树β-葡萄糖苷酶基因克隆、表达和分布定位

作　者: 李远华
导　师: 江昌俊
学　校: 安徽农业大学
专　业: 茶学
关键词: 茶树 β-葡萄糖昔酶基因 cDNA 原核表达 mRNA 原位杂交原位PCR
分类号: S571.1
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

茶树体内的各种物质代谢、能量传递、信息转录以及生长发育等都必须有酶的参与，酶对茶叶品质形成具有重要意义，酶学研究是茶叶的重要理论。而β—葡萄糖苷酶与茶叶香气有关，香气是衡量茶叶品质好坏的重要指标之一。 β—葡萄糖苷酶属于水解酶类，存在于自然界许多植物体，还存在于一些酵母、曲霉菌、木霉菌属及细菌体内。它的特性是可水解结合于未端、非还原性的β-D-糖苷键，同时释放β-D-葡萄糖和相应的配基；此外还能微弱地水解对硝基苯-β-D-半乳糖和β-D-木糖苷。在纤维素的糖化作用中，β-葡萄糖苷酶功能是将纤维素二糖和纤维素寡糖水解成葡萄糖。根霉能在许多种纤维素物质上生长，正是由于它能产生包括β-葡萄糖苷酶在内的多种纤维素酶所致。在茶叶上研究主要是该酶与萜烯类香气前驱体有密切关系，使糖苷键合态变成游离态。对茶叶中β-葡萄糖苷酶的研究，最早是1981年Takeo T利用茶叶匀浆试验，发现茶叶匀浆添加β-葡萄糖苷酶后，亦能产生芳樟醇和香叶醇，证实茶叶中存在以葡萄糖苷形式存在的单萜烯醇。目前对茶树β-葡萄糖苷酶的研究已深入到其与茶树品种、生态因子、加工工艺上。从分子生物学水平，研究β-葡萄糖苷酶基因克隆和表达，在燕麦、蜀黍、旱金莲、长春花、黄檀等许多植物中都有报道，但在茶树上至今国内外未见报道。本实验针对β-葡萄糖苷酶研究现状，主要从以下几方面来研究：茶树β-葡萄糖苷酶cDNA的克隆及在原核中表达，茶树中β-葡萄糖苷酶基因mRNA表达和分布定位情况。茶树β-葡萄糖苷酶cDNA的克隆，主要采用江昌俊等人方法提取茶树RNA和Gibco公司3′／5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒进行，研究结果表明，茶树β-葡萄糖苷酶cDNA全长序列1475bp，该序列的ORF由1350个核苷酸组成，编码450个氨基酸，5′非翻译区（5′-UTR）与3′非翻译区（3′-UTR）分别为33个和92个核苷酸组成。信号肽由28个氨基酸组成。预测序列氨基酸功能结构域有：4个N-豆蔻酰化位点(NSTK²⁰²、NFTK²⁰⁶、NRTQ²³⁸、NRSS³⁰⁷，5个蛋白激酶C的磷酸化位点(SNR¹⁸⁵、STK²⁰²、TSK²⁴⁷、TLR²⁷⁰、STR³⁷¹)，2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(SIVF¹¹²、TLNE³⁵⁰)，5个N-糖基化位点(GGHASK⁶⁷、GQASGS²⁸¹、GIRCCR²⁸⁸、GGLCAA³¹⁷、GQKGSG³³¹)。其核苷酸序列同安徽农业大学博士学位论文:中文摘要源性分析，与一些木本植物有比较高的相似性。与草本植物相对更低。从推导出的氨基酸序列保守性来看，第88、420、614有氨基酸残基的G，第204个氨基酸残基Y，第345个氨基酸残基I，其氨基酸序列完全保守，另有10%左右序列与部分植物比较一致。从系统进化树来看，茶树与黄檀植物亲缘关系最近，与鼠耳芥中的一个种类（AY045953）和小干松也比较相近，与大麦植物关系较远，而与玉米中的一个品种（U25157）关系最远，反映了茶树与这些植物物种间差异较大。预测茶树母一葡萄糖昔酶二级结构可以形成14.33%的a一螺旋、25.43%的日一折叠。茶树p一葡萄糖昔酶在原核中表达，主要采用Novagen公司菌株点co1z’ BL21trxB （DE3）和表达载体pET一32a进行p一葡萄糖昔酶表达，酶活性测定参考张正竹的方法。研究结果显示，实际诱导表达的茶树p一葡萄糖昔酶成熟蛋白分子量为37KDa，pET一32a/Mp一Glc融合蛋白在工PTG诱导3h的表达量最高，表达量占菌体总蛋白的32.2%，表达的蛋白经测定具有正常的生物学活性。在诱导0h时没有表达蛋白，诱导o.sh时表达的蛋白量很少，诱导lh、2h时表达量逐渐增加，诱导4h、7h时表达量也基本稳定在3h的水平，表达量没有明显增多。不同培养温度对表达蛋白也有影响，在Ilnmol.L一‘工PTG诱导3h，45℃与37℃表达量差不多，26℃比37℃表达量要少，26℃表达蛋白量在工PTG诱导3h时仅37℃的1/10。采用0.1、0.5、Ilnmol.L一‘工PTG三种浓度诱导表达，37℃同样诱导3h，表达蛋白量差异不大。不同部位的表达蛋白存在形式来看，培养基组分中没有发现目的蛋白，周质中也没有发现有表达蛋白，而原核细胞中可溶性细胞质蛋白和不可溶的细胞质蛋白却有较多的表达，其中可溶性细胞质蛋白比不溶性多些，可溶性细胞质蛋白占表达总蛋白的3/5，不可溶的细胞质蛋白占表达总蛋白的2/5。茶树p一葡萄糖营酶mRNA变化研究，采用Roche公司地高辛RNA标一记试剂盒，原位杂交过程参考武汉博士德公司的方法。表达结果茶树叶片的p一葡萄糖昔酶mRNA表达主要部位在栅栏组织，上表皮、下表皮、海绵组织等其它的组织则只有较弱的表达信号;叶片栅栏组织mRNA表达分布，在细胞核表达信号强，清晰、色明，细胞质部分有表达信号，其中包括液泡等部分细胞质没有表达信号;叶片的海绵组织内，细胞核有表达信号，但比栅栏组织弱，少部分的细胞质有表达信号;叶片上表皮细胞核有弱表达信号，细胞质只有少部分有表达信号;叶片下表皮细胞核有弱表达信号，细胞质部分有表达信号。茶树叶主脉的p一葡萄糖营酶基因mR琳表达部位在薄壁组织，韧皮部也很难观察到表达安徽农业大学博士学位论文:中文摘要信号，而上、下表皮和?

全文目录

中文摘要  6-9
ABSTRACT  9-13
第一章前言  13-28
  1 β-葡萄糖苷酶与茶叶香气  13-14
  2 茶树分子生物学研究进展  14-15
  3 β-葡萄糖苷酶研究现状  15-22
  4 原位杂交研究现状  22-26
  5 本研究内容及目的意义  26-28
第二章茶树β-葡萄糖苷酶cDNA克隆  28-52
  1 材料与方法  28-36
    1.1 材料  28
    1.2 主要仪器设备  28
    1.3 主要试剂  28
    1.4 克隆载体流程图  28
    1.5 方法  28-36
      1.5.1 仪器和试剂的预处理  28-29
      1.5.2 茶树总RNA的提取与鉴定  29-30
      1.5.3 β-葡萄糖苷酶基因片段克隆  30
      1.5.4 RT-PCR反应  30-34
      1.5.5 3′／5′RACE扩增  34-35
      1.5.6 序列分析  35-36
  2 结果与分析  36-50
    2.1 茶树总RNA的分析  36
    2.2 逆转录cDNA第一链的鉴定  36-37
    2.3 β-葡萄糖苷酶基因特异片段的RT-PCR扩增分析  37-38
    2.4 β-葡萄糖苷酶基因特异片段克隆的酶切鉴定  38
    2.5 3′ RACE扩增分析  38-39
    2.6 5′ RACE扩增分析  39-40
    2.7 β-葡萄糖苷酶cDNA序列的分析  40-50
      2.7.1 β-葡萄糖苷酶基因预测蛋白的特征分析  40-45
      2.7.2 植物β-葡萄糖苷酶核苷酸序列比较  45-46
      2.7.3 β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列多重比较  46-47
      2.7.4 茶树与其它植物－葡萄糖苷酶的氨基酸序列多重比较  47
      2.7.5 β-葡萄糖苷酶系统进化树分析  47-50
  3 讨论  50-51
  4 小结  51-52
第三章茶树β-葡萄糖苷酶cDNA原核表达  52-66
  1 材料与方法  52-57
    1.1 材料  52
    1.2 方法  52-57
      1.2.1 β-葡萄糖苷酶cDNA片段的分离和克隆  52-54
      1.2.2 表达蛋白  54-55
      1.2.3 目的蛋白分析  55-56
      1.2.4 不同诱导时间、不同培养温度、不同IPTG浓度处理  56
      1.2.5 SDS-PAGE聚丙烯凝胶电泳  56
      1.2.6 表达蛋白的活性测定  56-57
  2 结果与分析  57-63
    2.1 Mβ-Glc编码区cDNA片段扩增  57
    2.2 重组表达质粒的酶切鉴定  57-58
    2.3 在pET-32a表达系统中的表达  58-62
      2.3.1 不同诱导时间的表达情况  60
      2.3.2 不同培养温度的表达情况  60-61
      2.3.3 不同IPTG浓度表达情况  61-62
      2.3.4 表达蛋白的存在形式  62
    2.4 表达蛋白活性测定  62-63
  3 讨论  63-65
  4 小结  65-66
第四章茶树β-葡萄糖苷酶mRNA表达的研究  66-84
  1 材料与方法  66-72
    1.1 材料  66
    1.2 主要仪器  66
    1.3 主要试剂  66
    1.4 转录载体pGEM－4ZF（＋）/-Glc构建（图24）  66
    1.5 方法  66-72
      1.5.1 原位杂交技术路线  66
      1.5.2 构建pGEM-7ZF(+)重组质粒载体  66-69
      1.5.3 β-葡萄糖苷酶基因RNA探针制备  69-70
      1.5.4 石蜡切片  70-71
      1.5.5 杂交  71-72
  2 结果与分析  72-81
    2.1 重组质粒构建与与酶切  72-73
    2.2 茶树β-葡萄糖苷酶的mRNA表达  73-81
      2.2.1 营养器官的β-Glc-mRNA  73-74
      2.2.2 不同品种的β-Glc-mRNA  74-76
      2.2.3 春、夏、秋梢叶子β-Glc-mRNA  76-77
      2.2.4 不同加工技术的影响  77-78
      2.2.5 茶树营养组织细胞中的β-Glc-mRNA  78-81
  3 讨论  81-83
  4 小结  83-84
第五章茶树β-葡萄糖苷酶基因的定位原位扩增研究  84-91
  1 材料与方法  84-85
    1.1 材料  84
    1.2 主要仪器  84
    1.3 主要试剂  84
    1.4 方法  84-85
      1.4.1 原位PCR技术路线  84-85
      1.4.2 组织制备  85
      1.4.3 组织细胞渗透处理  85
      1.4.4 LISA  85
      1.4.5 检测  85
      1.4.6 设立对照  85
  2 结果与分析  85-89
    2.1 槠叶齐品种原位PCR定位  85-88
    2.2 福鼎大白茶品种原位PCR定位  88-89
  3 讨论  89-90
  4 小结  90-91
总结  91-93
研究展望  93-95
参考文献  95-104
附录  104-105
致谢  105-106
攻读博士期间发表的文章、参加研究课题  106

茶树β-葡萄糖苷酶基因克隆、表达和分布定位

内容摘要

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