多粘类芽孢杆菌是一种植物根际促生菌,具有固氮、解磷、产生抗生素、分泌植物激素、几丁质酶和水解酶,可以提高土壤肥力等特点,同时研究发现多粘类芽孢杆菌,对人和动物没有致病性,某些菌株具有抗菌活性。本实验室筛选的多粘类芽孢杆菌应用于微生物有机肥" />

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FISH检测多粘类芽孢杆菌研究及其在猪粪有机肥和土壤中的应用

作　者: 张秋霞
导　师: 徐阳春
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物营养学
关键词: 多粘类芽孢杆菌荧光原位杂交芽孢有机肥土壤
分类号: S144
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

芽孢杆菌的学位论文">多粘类芽孢杆菌是一种植物根际促生菌,具有固氮、解磷、产生抗生素、分泌植物激素、几丁质酶和水解酶,可以提高土壤肥力等特点,同时研究发现多粘类芽孢杆菌,对人和动物没有致病性,某些菌株具有抗菌活性。本实验室筛选的多粘类芽孢杆菌应用于微生物有机肥的研制,取得了良好的应用效果。为进一步研究多粘类芽孢杆菌微生物有机肥的作用机理,本研究建立了荧光原位杂交(FISH)检测多粘类芽孢杆菌菌体和芽孢的方法,并对此方法的操作步骤和实验条件进行优化,旨在为有机肥和环境条件中的多粘类芽孢杆菌的检测技术提供理论基础。本文研究结果如下：1. FISH检测多粘类芽孢杆菌菌体的最优化实验条件为：样品收集时进行1×PBS冲洗2-3次；无水乙醇4℃固定2h；0.01%SDS处理分散菌体；杂交温度为48℃,时间为2h,甲酰胺浓度为35%,清洗液中NaCl浓度为60 mM。2. FISH检测多粘类芽孢杆菌芽孢的预处理方法有化学预处理和萌发预处理,10M HCl 37℃处理30 min,0.1 M NaOH0℃处理30 min,10 mg/mL SDS+50 mM DTT 60℃处理15 min和1 mg/mL溶菌酶37℃处理15 min为化学预处理,杂交效率分别为75.2%,86.6%和64.7%,扫描电镜显示,化学预处理芽孢表面结构松散,少数裂解。L-丙氨酸+腺苷+水解酪蛋白37℃处理5 min为萌发预处理,杂交效率为92.3%,扫描电镜显示,萌发预处理芽孢膨胀,表面结构光滑,形态完整。3.利用萌发预处理FISH和平板计数同时对接种在猪粪有机肥中的多粘类芽孢杆菌SQR21进行检测,结果发现FISH方法与平板方法计数芽孢数和总数,均有一个数量级的差别,而且FISH能更准确地反映芽孢变化的过程。4.FISH检测添加多粘类芽孢杆菌的猪粪有机肥在发酵过程中的菌体生长变化,结果发现第2天和第3天细胞均有显著增长现象,且大多数为营养体细胞；发酵第5天细胞无增长现象,芽孢开始出现；发酵第10天细胞总量显著减少,大部分细胞以芽孢形式存在；发酵第20天细胞总量无明显变化,芽孢占绝对优势。

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摘要 8-9ABSTRACT 9-11第一章文献综述 11-29 1.0 研究意义 11 1.1 芽孢杆菌的学位论文">多粘类芽孢杆菌及其促生机理 11-12 1.1.1 多粘类芽孢杆菌 11-12 1.1.2 多粘类芽孢杆菌的促生作用机理 12 1.2 微生物的检测方法 12-15 1.2.1 传统方法 12 1.2.2 分子生物学方法 12-15 1.2.2.1 PCR扩增技术 12-13 1.2.2.2 DNA测序法 13-14 1.2.2.3 变性梯度凝胶电泳 14 1.2.2.4 抗生素标记法 14 1.2.2.5 外源基因标记 14 1.2.2.6 标记核酸探针杂交技术 14-15 1.3 荧光原位杂交 15-23 1.3.1 FISH技术简介 15-16 1.3.2 FISH技术的操作步骤 16-20 1.3.2.1 FISH探针的选择和制备 17-19 1.3.2.2 样品的固定 19 1.3.2.3 样品的预处理 19 1.3.2.4 杂交 19-20 1.3.2.5 漂洗 20 1.3.2.6 观察 20 1.3.3 FISH芽孢检测的研究 20-21 1.3.4 FISH技术的应用 21-22 1.3.4.1 FISH在环境微生物多样性检测方面的应用 21-22 1.3.4.2 FISH在污水处理中的应用 22 1.3.4.3 FISH在医学上的应用 22 1.3.4.4 FISH在微生物有机肥中的应用 22 1.3.5 环境样品中FISH定量分析的主要影响因素 22-23 1.3.5.1 操作过程 22-23 1.3.5.2 探针的特异性 23 1.3.5.3 荧光显微镜 23 1.3.5.4 计数 23 1.3.5.5 样品浓度 23 1.3.5.6 菌体自发荧光 23 1.4 研究内容 23-24 参考文献 24-29第二章 FISH检测多粘类芽孢杆菌方法的建立及其优化 29-41 2.0 引言 29 2.1 材料与方法 29-31 2.1.1 供试菌株 29 2.1.2 探针 29 2.1.3 样品的收集与制备 29-30 2.1.4 固定方法的确定 30 2.1.5 分散方法的确定 30 2.1.6 杂交温度和杂交时间的优化 30-31 2.1.7 杂交缓冲液和杂交洗涤液的优化 31 2.1.8 观察 31 2.2 结果与分析 31-36 2.2.1 样品收集时进行1xPBS冲洗和未进行冲洗的杂交结果 31-32 2.2.2 不同固定方法的杂交结果 32-33 2.2.3 不同分散方法的杂交结果 33-34 2.2.4 不同杂交时间和杂交温度对杂交效率的影响 34-35 2.2.5 杂交液中甲酰胺浓度和洗涤液中NaCl浓度对杂交效率的影响 35-36 2.3 讨论 36 2.4 小结 36-38 参考文献 38-41第三章 FISH快速检测多粘类芽孢杆菌芽孢的研究 41-53 3.0 引言 41 3.1 材料与方法 41-43 3.1.1 供试菌株 41 3.1.2 探针 41 3.1.3 样品的收集与制备 41-42 3.1.4 扫描电镜观察各种预处理的芽孢表面结构及形态变化 42-43 3.1.5 萌发预处理不同时间对SQR21芽孢杂交效率的影响 43 3.1.6 萌发预处理对营养体细胞杂交的影响 43 3.1.7 FISH检测猪粪有机肥中SQR21的变化 43 3.2 结果与分析 43-49 3.2.1 不同预处理对SQR21芽孢形态及荧光原位杂交效果的影响 43-46 3.2.2 萌发处理不同时间对SQR21芽孢荧光原位杂交效率的影响 46 3.2.3 萌发预处理对SQR21菌体荧光原位杂交的影响 46-47 3.2.4 FISH检测猪粪有机肥中多粘类芽孢杆菌的变化 47-49 3.3 讨论 49-50 3.4 小结 50-51 参考文献 51-53第四章 FISH技术检测有机肥和土壤中的SQR21 53-63 4.0 引言 53 4.1 材料与方法 53-55 4.1.1 供试有机肥和土壤 53 4.1.2 样品的制备方法 53-55 4.1.3 土壤中SQR21的FISH检测 55 4.1.4 猪粪有机肥中SQR21的FISH检测 55 4.2 结果与分析 55-59 4.2.1 不同方法收集猪粪有机肥和土壤中SQR21的杂交结果 55-56 4.2.2 土壤中SQR21的FISH检测 56-57 4.2.3 猪粪有机肥中多粘类芽孢杆菌的FISH检测 57-59 4.3 讨论 59 4.4 小结 59-61 参考文献 61-63全文结论 63-65附录 65-69致谢 69

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