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肝癌细胞中肿瘤基因P53/MDM2/P21与HBV关系的研究

作　者: 曲建慧
导　师: 朱明华
学　校: 第二军医大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 原发性肝细胞癌抑癌基因，p53 抑癌基因，p21 癌基因，mdm2 乙型肝炎病毒程序外DNA合成聚合醉链式反应基因转染细胞凋亡细胞周期阻滞细胞培养裸鼠成瘤实验
分类号: R735.7
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

P53是一种重要的抑癌基因，当细胞遭受损伤因素作用时，P53活化并激活一系列基因，构成“P53网络”，在细胞周期中发挥校正点功能，阻止损伤的DNA进行错配修复，从而防止细胞发生癌变。MDM2、P21是P53的下游基因，是“P53网络”重要的成员，与P53活性调节及其作用的正常发挥关系密切。p53变异或失活是肿瘤发生发展的重要分子事件。在人类原发性肝癌中，也普遍存在P53功能的丧失，而且由于HBV感染与原发性肝癌的密切相关性，HBV与P53的关系问题一直也是人们研究的热点之一。本研究在P53、HBV状态不同的几种肝癌细胞中检测了P53活性并观察了MDM2/P53/P21三种蛋白表达；观察了P53与细胞DNA切除损伤修复能力的关系；HBV以及HBV增强子Ⅰ上游P53样应答元件结合序列与P53的相互作用关系。主要见以下几个部分。一、不同肝癌细胞系中P53/P21/MDM2表达及与HBV关系分析选用背景状态不同的几种肝癌细胞系；HepG2、HepG2．2.15、PLC/PRF/5、HCC-9204、Hep3B，目前已知各细胞内P53状态以及细胞内HBV复制或整合的情况不同。首先用Western blot方法比较了几种细胞系中P53、P21、MDM2蛋白表达量的不同，并通过检测报告基因PG13-CAT、P21-LUC在细胞内的表达观察P53活性以及P53对P21启动子作用的差异。结果表明，PLC/PRF/5细胞具有较高水平的P53蛋白表达，但报告基因PG-13CAT转染细胞后，CAT酶为低表达，这可能由于该细胞中P53蛋白为变异形式，P53半衰期延长造成蛋白表达量增高，反式活化功能却降低或丧失；细胞中P21蛋白存在一定水平的表达，而且报告基因P21-LUC转染细胞后，荧光素酶报告基因也高表达，说明PLC/PRF/5细胞中存第二军医大学博士学位论文中文摘要在不依赖于P53的途径对PZI的活化表达具有促进作用;而在H即3B细胞，由于P53全基因缺失，细胞中无P53蛋白表达，P21蛋白以及P21一LUC报告基因处于相对较低水平:HCC一9204细胞中存在低水平的P53与PZI蛋白表达:与HepGZ细胞相比，HepG2.2.巧较H即G2具有较高的P53、PZI蛋白表达，而且报告基因PG13一以T、P21一LUC在H即G2.2.15细胞中表达均高于H即G2细胞，考虑这可能与细胞中HBV的复制有关。HBv在细胞内的复制可能通过P53依赖或非依赖的途径对P21具有促进作用。从MDMZ的表达情况来看，发现MDMZ与P53的表达具有相反的趋势:在姗M2表达偏低的细胞，P53表达偏高，如PLC/PRF/5，HepGZ(HepG2.2.15)细胞;而在MDMZ高表达的HCC一9204、H即3B细胞，P53表达偏低或无表达。说明MDMZ对于野生型或变异型P53可能都具有降解作用。选用HepGZ、Hepe2.2.15、Hep3B、PLe/pRF/5四种肝癌细胞系。分别给予一定剂量的紫外线照射，Western blot方法检测P53蛋白表达的改变，用‘H掺入法通过检测细胞的程序外DNA合成，观察各细胞DNA切除损伤修复能力。结果发现，PLC/PRF/5细胞在紫外线照射前后P53蛋白表达没有明显改变;H即3B细胞照射前后P53蛋白均无表达:在H即G2、H即G2.2.15细胞，发现紫外线照射后的P53蛋白表达明显增强。HePGZ、H即G2.2.15细胞对紫外线诱导的DNA损伤修复能力明显高于pLc于R卫/5、HeP3B细胞。说明在具有P53活性表达的细胞，紫外线照射可以通过活化细胞内P53，促进细胞的DNA损伤修复，帮助细胞度过损伤。HepGZ细胞的DNA切除损伤修复能力相对强于H即G2.2.15细胞，这可能与HePG2.2.15细胞中HBV的复制有关，提示HBv通过干扰损伤DNA修复，而与肝癌的发生有关。二、HBv与P53作用关系初步研究在上面实验中，发现HePG2.2.15细胞中P53活性以及P53于21表达较HepGZ明显增高，本实验进一步比较了HePGZ与HepG2.2.15细胞生物学活性以及成瘤性，并在7721肝癌细胞系中，通过细胞内转染HBV与P53质粒，观察了HBV对P53活性、蛋白表达以及对P53下游基因PZI基因启动子的影响，以及P53对HBV病毒复制的作用，并观察了二者作用对细胞凋亡的影响。结果显示，HePG2.2.巧细胞的增殖与凋亡特性均强于H即G2细胞，并且具有成瘤性。7721第二军医大学博士学位论文中文摘要细胞内转染HBV质粒具有增强P53蛋白表达以及P53功能的作用，使P53对PZI基因启动子的激活作用进一步增强，细胞凋亡率明显增加，细胞生长抑制。这说明HBv在细胞内复制对细胞的凋亡与增值均具有增强作用，二者处于对抗平衡的作用，感染早期，细胞凋亡占优势，而当细胞的增殖占优势时，就会生成肿瘤。荧光定量PCR方法检测HBv质粒细胞内转染后HBv的复制情况，发现细胞内P53的表达对HBv的复制也具有一定的促进作用。三、P53与HBv增强子I上游P53样应答元件结合序列关系研究前期工作中发现，在HBv基因组增强子I上游存在P53样应答元件结合序列，TGCC(G)T.··…TGCCT，体外实验发现这段序列与P53蛋白能够进行特异性结合;在以上的实验中，也发现P53对HBv的复制具有一定的促进作用(野生型P53的反式激活作用需依赖于其与DNA序列的特异结合)。本实验进一步观察了P53与HBV基因组上P53样应答元件结合序列之间的作用关系:报告基因质粒PX一以T上含有HBV的这段DNA序列，首先

全文目录

中文摘要  5-8
英文摘要  8-12
英文缩写词表  12-13
前言  13-15
第一部分不同肝癌细胞系P53／P21／MDM2表达及其与HBV关系分析  15-33
  一 P53／MDM2／p21蛋白表达及关系探讨  15-22
    材料与方法  15-22
  二不同P53、HBV背景的肝癌细胞核酸切除损伤修复能力的观察  22-33
    材料与方法  22-24
    结果  24-28
    讨论  28-33
第二部分 HBV与P53作用关系初步研究  33-53
  一 HepG2与HepG2.2.15细胞生物学活性的比较  33-39
    材料与方法  33-35
    结果  35-39
  二 P53与HBV相互作用对7721细胞凋亡及P21启动子的影响  39-53
    材料与方法  39-43
    结果  43-50
    讨论  50-53
第三部分 P53与HBV增强子I上游P53样应答元件结合序列关系研究  53-75
  一 HBV基因P53样应答元件结合序列在报告基因pX-CAT上位点变异以及反义真核表达质粒的构建  53-64
    材料与方法  53-62
    结果  62-64
  二细胞内P53与HBV增强子I上游P53样应答元件序列作用关系观察  64-75
小结  75-77
参考文献  77-85
  第一部分  77-81
  第二部分  81-83
  第三部分  83-85
文献综述  85-104
  一 HBV增强子及其调节因子  85-93
  二乙肝病毒HBX抗原与P53相互作用及其对肝细胞癌发生的影响  93-98
  综述一参考文献  98-101
  综述二参考文献  101-104
致谢  104-106
附录  106

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