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人类嗜T淋巴细胞病毒Ⅰ型重组env抗原的表达

作　者: 朱庆华
导　师: 赵国强；王中全
学　校: 郑州大学
专　业: 病原生物学
关键词: HTLV-I 重组抗原表达
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

背景和目的人类嗜T淋巴细胞病毒(Human T-cell Lymphotropic Virus,HTLV)是最早发现的人类逆转录病毒,其在病毒分类中属于逆转录病毒科肿瘤病毒亚科哺乳类C型病毒。人类嗜T淋巴细胞白血病病毒(HTLV)分为Ⅰ型和Ⅱ型。HTLV-Ⅰ可以导致成人T细胞白血病(adult T cell leukemia/lymphoma,ATL)、热带痉挛性麻痹症/HTLV-Ⅰ相关的脊髓病(Tropical spastic paraparesis/human T-cell lymphotropicvirus typeⅠ-associated myelopathy,TSP/HAM)等疾病,HTLV-Ⅱ可能与T细胞增生紊乱等有关。HTLV-Ⅰ流行广泛分布、局部地区高发。国内10多个省市都发现了HTLV感染病例,并且发现在沿海的某些地区有集中流行。HTLV主要通过输血、性接触、哺乳等方式传播。日本、美国、、法国及其它一些国家和地区已将其列为献血员必检项目。国内使用的HTLV-Ⅰ筛检试剂均为国外试剂,而制约国内HTLV-Ⅰ筛检试剂开发的瓶颈是其特异性抗原。为此,本实验采用分子生物学技术,利用原核和真核表达载体表达env重组抗原,为HTLV-Ⅰ筛检试剂的研制奠定基础。实验方法分析HTLV-Ⅰenv基因和其编码的gp46蛋白和gp21蛋白的氨基酸序列。选择抗原决定簇丰富区(5915nt-6545nt)的630bp基因序列为目的基因。人工合成目的基因,在两端加上BamHI和PstⅠ酶切位点。将目的基因片段分别克隆进入原核表载体pQE80L和真核表达载体pcDNA4/HisMax-A。利用PCR扩增和BamHI、PstⅠ酶切鉴定重组子pQE80L-env、pcDNA4/HisMax-A-env;然后行序列测定。将pQE80L-env转入DH5α,1mmol/L IPTG诱导表达;亲和层析纯化原核表达重组env蛋白抗原。转染pcDNA4/HisMax-A-env入NIH3T3,培养48h,亲和层析纯化真核表达重组env蛋白抗原。Western-blot检测原核/真核表达重组env蛋白抗原的活性。利用ELISA方法测试两种重组env蛋白抗原特异性。实验结果1.PCR扩增和BamHI、PstⅠ行酶切筛选得到重组子pQE80L-env和pcDNA4/HisMax-A-env。DNA序列测定证明重组子插入序列与设计一致。2.原核表达,SDS-PAGE分析显示表达的重组蛋白相对分子质量约25KDa,与预期分子量相符。免疫印迹显示,在约25KDa有一明显特异印迹条带,说明原核表达的重组蛋白具有HTLV-Ⅰenv抗原性。3.转染细胞培养48h,SDS-PAGE分析,可见相对分子质量约为27KDa目的重组蛋白表达,与预期融合蛋白大小相符。免疫印迹显示,在约27KDa有明显特异印迹条带,说明真核表达的重组蛋白有HTLV-Ⅰenv抗原性。4.原核表达纯化的重组env抗原ELISA检测结果:正常人、HIV阳性和HTLV-Ⅱ阳性的血清均为阴性;HTLV-Ⅰ阳性血清为强阳性。5.真核表达纯化的重组env抗原ELISA检测与原核表达抗原一致,统计学比较,差异没有显著性差异(p＞0.05)。结论HTLV-Ⅰenv基因5915nt-6545nt区,利用原核和真核表达系统表达得到特异性HTLV-Ⅰ重组抗原;两种重组抗原无显著性差异,有望成为检测试剂抗原。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-9
论文部分人类嗜T淋巴细胞病毒Ⅰ型重组env抗原的表达  9-40
  1 引言  9-11
  2 实验材料  11-17
  3 实验方法  17-25
  4 实验结果  25-33
  5 讨论  33-35
  小结  35-36
  参考文献  36-40
综述部分人类嗜T淋巴细胞病毒研究进展  40-53
  参考文献  47-53
附录部分  53-55
  英文缩略词表  53-54
  攻读硕士研究生期间公开发表的论著  54-55
  致谢  55

人类嗜T淋巴细胞病毒Ⅰ型重组env抗原的表达

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