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广谱抗LPS-McAb的交叉反应性及内毒素定量双抗体夹心ELISA的建立

作　者: 徐修礼
导　师: 薛采芳；于文彬
学　校: 第四军医大学
专　业: 病原生物学
关键词: LPS McAb 交叉反应性 ELISA 定量检测
分类号: R392-33
类　型: 硕士论文
年　份: 2001年
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内容摘要

脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌外膜的主要组成部分，小剂量的LPS即可引起广泛的生物学反应。临床上约65％败血症是由革兰氏阴性菌引起的，死亡率达22.7％～40％。长期以来，临床实验诊断内毒素血症多采用鲎试验法（LT），由于鲎试剂自身的非特异性及血浆中诸多因素的影响，尽管多年来进行了许多改进，特异性仍不能令人满意。ELISA方法是临床实验诊断中应用最为广泛的方法之一，但在内毒素检测方面，虽有少数文献报道，但由于结果不满意而未能实际应用，其主要的原因是难以获得具有广泛交叉反应性的内毒素单抗；其次，内毒素包被微板比较困难。本研究是利用本科研制的两株具有广泛交叉反应性的内毒素单抗探索合适条件，首次建立检测内毒素的双抗体夹心ELISA方法，旨在为临床提供一个简单快速、特异性强、敏感性高的内毒素检测方法。本研究的内容主要有三部分：一 1．杂交瘤细胞腹水产生影响因素的观察为了获得大量的杂交瘤腹水，我们对预处理小鼠的佐剂种类。小鼠类型和杂交瘤细胞系等因素对腹水产生的影响进行了观察。结果：①用降植烷与福氏不完全佐剂预处理小鼠比液体石腊效果显著，前者不但腹水产生的快，而且量也多（P＜0．0引；②经产雌鼠比未产仔鼠的腹水产量明显增多，而未产仔雌鼠与雄鼠之间腹水产量无明显差异；③C3AZ杂交瘤株的腹水产量比H3D3的多，但二者差异不明显（P＞0刀5）。 2。两株单抗对不同种属细菌的LPS交叉反应谱的确认 LPS单抗对不同种属细菌的LPS是否具有广泛的交叉反应性是建立检测内毒素双抗体夹心ELISA方法的基础和关键。为此，我们收集了 ZI属 48种细菌，用 l旬接 ELISA法和 PHA法对两株单抗进行了交叉反应谱的检测。其结果为：两株单抗对肠杆菌科细菌汐埃希氏菌属。肠杆菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属等）交叉反应性最强，对非发酵糖的革兰阴性细菌怕不动杆菌属、假单胞菌属、产碱杆菌属等）交叉反应性相对较弱，而对念珠菌属的交叉反应性与非发酵糖的细菌相似，对革兰氏阳性球菌不引起交叉反应，ELISA法和 PHA法的交叉反应性结果基本一致。C3AZ单抗虽比H刃3单抗的交叉反应性高，而二株单抗的反应广谱性基本一致，证实了用 LPS－HDL作抗原筛选出的两株广谱性抗 LPS MCAb 可作为检测工PS的抗体应用。 3．内毒素检测的双抗体夹心 ELISA方法的建立和初步应用根据文献。我们在探讨了紫外线照射微孔板与否、洗涤液和抗体稀释液的种类。封闭液的种类等对结果影响的基础上，建立了检测内毒素的双抗体夹心ELISA法。对该法的敏感性、特异性、准确性和重复性等进行了实验，并初步检测了40份临床标本。实－4－一验结果表明，该法的敏感性最低可检出50pg／hl的LPS，优于鲨试验定性法及所有文献报道的间接ELISA法，虽较定量鲨试剂仪器比浊法（敏感性为lp咖1）低，但其特异性优于鲨试验定性法和仪器比浊法，且重复性和准确性好。本实验首次建立了内毒素检测的双抗体夹心ELISA法，实验结果表明该法在临床内毒素检测中将会有广泛的应用前景。虽然其敏感性高于所有文献己报道的检测内毒素的间接ELISA方法，但尚须进一步提高。

全文目录

英文缩写词表  3-5
中文摘要  5-8
英文摘要  8-11
前言  11-12
文献回顾  12-35
  一、 LPS的基本结构和抗原性变化  12-13
  二、抗LPS McAb的研究进展及其应用  13-18
  三、细菌内毒素的产生，作用机理及生物学效应  18-22
  四、细菌内毒素检测进展  22-29
  五、血浆内毒素测定的临床意义  29-35
研究内容  35-62
  第一部分 LPS抗体的制备及纯化  36-43
    材料与方法  36-38
    结果  38-42
    讨论  42-43
  第二部分抗LPS-McAb交叉反应性鉴定  43-49
    材料与方法  43-46
    结果  46-48
    讨论  48-49
  第三部分内毒素定量双抗体夹心ELISA法的建立及初步应用  49-62
    材料与方法  49-54
    结果  54-59
    讨论  59-62
小结  62-63
致谢  63-64
参考文献  64-70

广谱抗LPS-McAb的交叉反应性及内毒素定量双抗体夹心ELISA的建立

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