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背景与目的:急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)的发生、发展和转归是当今外科领域研究的热点,其发病机理尚未完全阐明。其中急性胆源性胰腺炎(acute biliary pancreatitis,ABP)在我国发病率最高,占AP总数的50-80%。目前普遍认为,ABP是由于胆管炎症、结石、寄生虫、水肿、痉挛等病变使壶腹部发生梗阻,加之胆囊收缩,胆管内压力升高,胆汁通过共同通道反流入胰管,激活胰酶原,导致胰腺自身消化而引起胰腺炎。但其确切的发病机制尚未完全明确。可以认为,随胆汁异常反流入胰管的胆汁酸,造成胰腺腺泡细胞功能与结构损害是大多数ABP发病的一个关键性因素。因此,本研究探讨胆汁酸7种不同成分对胰腺腺泡细胞的损伤作用,检测在各种胆汁酸作用下胰腺腺泡细胞的存活率,凋亡/坏死的改变,观察对腺泡细胞分泌功能的影响,并探究细胞核转录因子的DNA结合活性的变化,研究大黄素对胆汁酸诱导的胰腺腺泡细胞损伤的保护性作用;同时,进一步揭示急性胆源性胰腺炎大鼠发病中,胆汁酸对胰腺的损伤性作用及其机制,观察中药清胰汤的治疗作用,为揭示急性胆源性胰腺炎的发病机制和寻求更为有效的防治措施提供新的实验佐证。方法:实验一:以大鼠AR42J胰腺腺泡细胞系为研究对象,应用MTT方法检测7种不同胆汁酸对细胞存活率的影响和剂量与时间依赖性关系,采用光学显微镜和荧光显微镜观察细胞形态学改变与凋亡/坏死的变化,流式细胞术AV/PI双染法检测细胞的凋亡/坏死率。细胞经0.4mM DCA作用15min,30min,1h,4h后分别收集细胞培养液上清检测淀粉酶活性,提取细胞浆和细胞核蛋白,分别检测各组细胞浆淀粉酶的活性,利用Luminex检测40种细胞核转录因子(TF)的DNA结合活性的变化。实验二:大黄素(Emodin)是治疗急性胰腺炎中药方剂的一种主药,通过体外实验观察其对胆汁酸诱导的胰腺腺泡细胞损伤的保护性作用和影响。以大鼠AR42J胰腺腺泡系为研究对象,分为三组,分别为CON组,0.4mM DCA刺激组和0.4mM DCA+Emodin(20μM)干预组,利用流式细胞术AV/PI双染法检测各组细胞凋亡/坏死率,以上各组进一步按照不同时间点分为4组:15min,30min,1h和4h,于相应时间点分别收集细胞培养液上清检测淀粉酶活性,提取细胞浆和细胞核蛋白,分别检测各组细胞浆淀粉酶的活性,利用Luminex检测40种细胞核转录因子(TF)的DNA结合活性的变化。实验三:经胆胰管逆行注入不同浓度去氧胆酸钠制备大鼠急性水肿性胰腺炎(AEP)和急性坏死性胰腺炎(ANP)模型。40只SD大鼠随机分为假手术组、AEP组、ANP组及对ANP的清胰汤治疗组(1ml/100g),每组10只。治疗组大鼠于造模后立即一次和造模后12h再次给药。24h后采取标本做病理检查和各项指标检测。光镜下观察各组胰腺标本病理改变,进行组织学评分;采用TUNEL技术检测胰腺腺泡细胞的凋亡,计算凋亡指数;应用分光光度法检测凋亡蛋白酶Caspase-3,8和9的活性变化。结果:胆汁酸7中主要成分对胰腺腺泡细胞的损伤作用不同,其中DCA,CDCA,LCA和TDCA 4种胆汁酸细胞毒作用明显,呈剂量和时间依赖性诱导腺泡细胞凋亡和坏死,CA,GCA和GDCA则不具有细胞毒作用。胆汁酸DCA和CA对腺泡细胞淀粉酶的合成与分泌功能均没有显著影响,在检测的40种核转录因子(TF)的DNA结合活性中,DCA诱导AR42J胰腺腺泡细胞核内ATF2,AR33,STAT5,NFAT,FKHR和NKX-2.5这6种核转录因子(TF)的DNA结合活性显著升高,而RUNX/AML,NF-Y,MEF2和E2F1这4种TF的DNA结合活性则明显下降,其余30种TF活性没有明显变化。20μM Emodin可以减少DCA诱导的AR42J胰腺腺泡细胞的凋亡与坏死,对细胞淀粉酶的合成与分泌功能没有明显影响,同DCA诱导的TF活性变化相比,Emodin升高PAX3, E2F1, RUNX/AML, NF-Y, IRF, MEF和NFAT这5种TF活性,降低FKHR的活性。大鼠体内实验结果表明,AEP组与ANP组腺泡细胞凋亡指数、Caspase-3,8和9的活性均显著高于假手术组,且AEP组腺泡细胞凋亡指数及凋亡蛋白酶的活性水平显著高于ANP组。同时,AEP组与ANP组病理组织学评分、血清淀粉酶、血清促炎性细胞因子等指标均较假手术组显著升高,且ANP组显著高于AEP组(p<0.01)。清胰汤通过诱导凋亡蛋白酶活性升高使ANP组大鼠胰腺腺泡细胞凋亡增多而坏死减轻,从而减轻胰腺组织损害和炎症因子水平。结论:胆汁酸主要的7种成分中,DCA,CDCA,LCA和TDCA在0.3-0.4mM的较低浓度,在24h内可导致大鼠AR42J胰腺腺泡细胞存活率显著下降,这种细胞毒作用呈时间和剂量依赖性关系,而CA,GCA和GDCA这3种胆汁酸则在1.0mM浓度内不会损伤腺泡细胞。胆汁酸对腺泡细胞的损伤作用主要表现为凋亡和坏死,对细胞内酶的合成和分泌功能没有明显影响。研究发现,DCA可诱导细胞6种TF的DNA结合活性显著升高和4种TF的DNA结合活性显著下降,从而影响相关基因的表达水平,是其造成细胞损伤的分子生物学基础。因此,本研究为胆汁酸诱导的胰腺腺泡细胞损伤提供有力的实验依据,并揭示了胆汁酸7种不同成分的作用特点和可能机制,将为探讨胆源性胰腺炎的发病机制和防治措施提供参考。Emodin对胆汁酸诱导的胰腺腺泡细胞损伤有一定的保护性作用,对细胞淀粉酶的合成与分泌功能没有明显影响。通过调节细胞TF的DNA结合活性,从而改变相关基因和蛋白的表达,可能是其发挥保护性作用的分子机制。急性胆源性胰腺炎时,胆汁酸诱导的胰腺腺泡细胞损伤时疾病发生的重要因素,腺泡细胞损伤主要表现为凋亡和坏死,且凋亡的多少与病情轻重呈负相关的关系,腺泡细胞凋亡可能是急性胰腺炎时机体的保护机制之一。凋亡蛋白酶Caspase依赖的凋亡调控通路参与腺泡细胞的凋亡调节,Caspase-8和9的活性均升高。清胰汤可通过诱导Caspase活性升高促进腺泡细胞凋亡而减轻ANP大鼠胰腺病理损害,降低血清淀粉酶、TNF-α、IL-6水平等,改善病情。如何有效控制AP发病时腺泡细胞的损伤,特别是减少坏死的发生,将会为临床进一步降低ANP的重症程度和病死率提供可能。
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