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Hsp90抑制剂—格尔德霉素的结构优化及抗病毒构效关系研究

作　者: 山广志
导　师: 李卓荣；陶佩珍；蒋建东
学　校: 北京协和医学院
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 格尔德霉素 Hsp90 抗病毒药物构效关系研究抑制剂先导物药代动力学生物利用度二氯甲烷氨基化合物合成浓度拉米夫定衍生物合成毒性研究取代衍生物活性研究单剂量细胞毒性口服给药
分类号: R965
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

近年来,随着病毒在体内复制分子机制的不断深入阐述,越来越多的病毒复制必需的宿主细胞蛋白被确定。通过细胞机制进行抗病毒感染已经成为抗病毒感染研究的新的热点领域。本研究所在细胞机制抗病毒方面开展了大量研究工作,并在包括以Hsp90等为靶点的作用于细胞蛋白抗病毒药物中取得了多方面的突破。本论文在前期研究工作的基础上,对作用于Hsp90的广谱抗病毒抗生素格尔德霉素进行结构优化与构效关系研究,以期发现具有新型结构类型和新型作用机制的广谱抗病毒药物。本论文研究中以Hsp90抑制剂——格尔德霉素为先导物,以降低先导物毒性并提高稳定性为目的,针对格尔德霉素的17位和19位进行结构改造。设计合成路线8条,实际完成7条,其中17、19位双取代路线为首次提出。本论文共合成化合物118个其中格尔德霉素衍生物53个,经检索有46个衍生物为全新结构。在合成的衍生物中,小分子胺基取代衍生物24个(A1-A22,H1和F1)；含核苷结构衍生物1个(B1)；氨基酸及二肽取代衍生物4个(Cl、C2、C6和C7)；含磺酸结构衍生物1个(C3)；含磷酸结构衍生物2个(C4和C5)；酰胺结构侧链衍生物2个(D1和D2)；含羟基侧链衍生物3个(E1-E3)；含糖基的衍生物4个(E4-E7)；17、19位双取代衍生,物11个(G1-G11)；还原型氢醌衍生物1个(H2)。所有目标物的结构均经1H NMR、MS等确证。体外抗病毒活性筛选研究结果,合成得到了体外抗病毒活性优于或相当于格尔德霉素的化合物多个,其中：衍生物A1、A2、A6、A13、A17、A18、A22和G11对HSV-1的IC50分别为0.082、0.065、1.06、0.939、0.541、0.866、0.20和1.28μg/ml,与格尔德霉素(IC50=0.975μg/ml)相当,均优于阳性药物阿昔洛韦(IC50=1.49μg/ml);对HSV-2的IC50分别为0.027、<0.009、1.04、0.968、0.703、2.34、0.05和0.74μg/ml,也与格尔德霉素(IC50=0.748μg/ml)相当,明显优于阳性药物阿昔洛韦(IC50=156μg/ml)。衍生物A6、A7、A13、A14、A16和A20对HIV-1的IC50分别为0.0284、0.013、0.0976、0.0736、0.0783和0.04μg/ml,与先导物(IC50<0.0305μg/ml)相当。衍生物A3、A13、A16、A17、E1、G3和G11等体外抑制HBV的IC50分别为0.24、0.01、0.009、0.081、0.119、0.105和0.17μg/ml,均优于阳性药物拉米夫定(IC50=0.84μg/ml)。衍生物A5、A6、A16、A21和C4对HCV的IC50分别为：0.08、0.03、0.05、0.11和0.002μg/ml,活性较先导物(IC50=0.0048μg/ml)略有降低,但衍生物A5、A6和A16的选择指数高于先导物。衍生物A5还显示了较好的体外抗VSV (IC50=0.479μg/ml)及抗CoxB3 (IC50=3.55μg/ml)、B6 (IC50=0.099μg/ml)活性。体外实验结果显示流感病毒对格尔德霉素衍生物不敏感。体内抗HSV病毒作用初步研究结果显示,在灌胃给予衍生物A11后,小鼠血清对HSV-1和HSV-2病毒的抑制率均高于阳性对照药阿昔洛韦和先导物格尔德霉素；灌胃给予衍生物A4后,小鼠血清HSV-2的抑制率较对照药及先导物增强。鸭体内抗DHBV作用研究结果显示,灌胃给予衍生物A16,A17和E2后,衍生物A16、A17和E2组在给药后第5天(T5)和给药后第10天(T10)病毒量与给药前(T0)比较有显著下降(P<0.01),E2和A16组在停药后第3天(P3)具有显著差异(P<0.05和P<0.01)。A17组在停药后第3天病毒量与给药前(T0)比较有显著性差异(P<0.05)。所有治疗组与病毒对照组的同期比较,病毒量均有明显的下降。衍生物A16的体内抗病毒作用超过或与拉米夫定相当。初步毒性研究结果,所合成衍生物的毒性较先导物格尔德霉素普遍降低10-20倍或以上。在衍生物体外细胞毒性测试中,小分子烷基胺衍生物A13、A17及A22对各细胞系的毒性与格尔德霉素相当,并明显高于其他衍生物；其他衍生物的细胞毒性较格尔德霉素均有大幅降低,TCso约是先导物的10～100倍。对实验小鼠腹腔注射给予不同剂量的衍生物的急性毒性试验中,先导物格尔德霉素的LD5o为15.5mg/kg,小分子烷基胺取代衍生物的LDso均在先导物的10-20倍附近,而双取代衍生物(G3)的LD5o更高(40倍以上)。理化性质研究结果,修饰后的格尔德霉素衍生物的水溶性较先导物有了较大提高(>10倍),脂水分布系数(logP)的测定结果显示,大部分衍生物更适于肠道吸收,预期具有较好生物利用度。修饰后衍生物(A5及A16)的光稳定性较先导物有了巨大提高,半衰期约是先导物的30～50倍。衍生物A5和A16的单剂量口服给药的药代动力学研究显示,小鼠灌胃给药后体内迅速吸收,生物利用度较好,两种衍生物在动物体内的代谢符合一室模型。综上所述,格尔德霉素结构修饰与优化研究结果,合成得到了抗病毒活性优于或相当于格尔德霉素、毒性显著降低、理化性质及药代动力学明显改善的新型广谱抗病毒候选化合物多个,其中,化合物A5及A16的抗病毒活性、毒性及药代动力学性质更为突出,具有进一步研发应用的前景。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-10
一、研究背景与研究目的  10-29
  (一) 研究背景  10-27
    1. 病毒和病毒感染性疾病  10-14
    2. 抗病毒药物的研究现状  14-17
    3. 抗病毒研究的新热点——细胞机制抗病毒  17-22
    4. HsP90抑制剂——广谱抗病毒抗生素格尔德霉素  22-27
  (二) 研究目的  27-29
    1、格尔德霉素衍生物的合成  28
    2、目标化合物抗病毒活性及毒性研究  28
    3、目标化合物理化性质研究  28
    4、目标化合物药代性质研究  28-29
    5、格尔德霉素衍生物抗病毒构效关系探讨  29
二、研究内容与方法  29-47
  (一) 合成路线设计  29-42
    1. 17位小分子烷基胺取代的格尔德霉素衍生物合成路线  30-31
    2. 17位连有核苷的格尔德霉素衍生物合成路线  31-33
    3. 17位连有氨基酸的格尔德霉素衍生物合成路线  33-34
    4. 17位乙二胺"桥链"的格尔德霉素衍生物合成路线  34-35
    5. 17位连有糖残基(包括多羟基侧链)的格尔德霉素衍生物合成路线  35-39
    6. 17位含有希夫碱结构的格尔德霉素衍生物合成路线  39-41
    7. 17、19位双取代格尔德霉素衍生物合成路线  41-42
  (二) 抗病毒活性及毒性测定  42
  (三) 理化性质考察  42-47
    1. 衍生物的溶解性  42-43
    2. 衍生物的脂水分配系数  43-45
    3. 衍生物溶液的光稳定性  45-47
  (四) 药代动力学考察  47
    1. HPLC法考察A5单剂量口服给药的药代动力学性质  47
    2. LC-MS/MS法考察A16单剂量口服给药的药代动力学性质  47
三、研究结果  47-98
  (一) 目标化合物合成  47-70
    1. 17位小分子烷基胺取代的格尔德霉素衍生物  47-50
    2. 17位连有核苷的格尔德霉素衍生物  50-56
    3. 17位连有氨基酸及肽链的格尔德霉素衍生物  56-59
    4. 17位乙二胺"桥链"的格尔德霉素衍生物  59-60
    5. 17位连有糖残基(包括多羟基侧链)的格尔德霉素衍生物  60-67
    6. 17位含有希夫碱结构的格尔德霉素衍生物  67-69
    7. 17,19双取代格尔德霉素衍生物  69-70
  (二) 抗病毒活性及毒性测定结果  70-81
    1. 抗病毒活性结果  70-78
      1.1. 体外抗病毒活性  70-76
      1.2. 衍生物体内抗病毒活性  76-78
    2.毒性研究结果  78-81
      2.3. 对Hela、MT-4、CEM、2.2.15、VERO和GS4.3细胞毒性实验  78-80
      2.4. 小鼠腹腔注射给药急性毒性实验  80-81
  (三) 理化性质考察结果  81-90
    1. 样品溶解性测定结果  81-82
    2. 合成化合物脂水分配系数测定结果  82-86
      2.1. 摇瓶法测定化合物脂水分配系数  82-83
      2.2. HPLC法评价化合物的脂水分配系数  83
      2.3. 计算机模拟估算化合物的脂水分布  83-84
      2.4. 测定结果的比较  84-86
    3. 衍生物溶液的光稳定性考察结果  86-90
      3.1. A5溶液120分钟光稳定性考察结果  86-87
      3.2. A16溶液120分钟光稳定性考察结果  87
      3.3. 5天光稳定性考察结果  87-88
      3.4. 格尔德霉素及其衍生物A5和A16的溶液光稳定性比较  88-90
  (四) 药代动力学实验结果  90-98
    1. HPLC法考察A5单剂量口服给药的药代动力学性质  90-94
    2. LC-MS/MS法考察A16单剂量口服给药的药代动力学性质  94-98
四、讨论  98-104
五、化学合成实验部分  104-150
主要参考文献  150-154
附录  154-250
  附录一部分化合物图谱  154-233
  附录二  233-236
  附录三  236-241
  附录四  241-246
  附录五缩略语对照表  246-247
  附录六发表文章及申请专利情况  247-249
  附录七致谢  249-250
  附录八  250

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