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基于成分敲出/敲入的中药（牛黄）药效物质辨识和质量控制模式的初步研究

作　者: 孔维军
导　师: 李祖伦；肖小河；王伽伯
学　校: 成都中医药大学
专　业: 中药学
关键词: 中药药效物质辨识质量控制成分敲出/敲入牛黄 “量-效”关系组分中药
分类号: R284
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

中药质量控制一直是中药现代化研究的难点和重点,而药效物质辨识则是支撑中药质量控制的前提和基石。然而,由于中药自身的复杂性,以及研究思路、方法和技术条件的限制,绝大多数中药的药效物质基础尚不清楚。在此背景下,现行主要以指标成分的定性定量分析为主要内容的中药质量控制模式,不可避免地陷入“难关药效,量而不准,难控难评”的窘局。为寻求解决中药药效物质辨识与质量控制问题的新突破,本文探索建立基于成分敲出/敲入的中药药效物质辨识和质量控制新模式：以成分敲出辨识中药关键药效组分(主要药效成分和/或药效相关成分)及其相互作用关系,实现质控指标“找得准,测得准”；以成分敲入确定关键药效组分的“量-效”关系,制定科学合理的药效组分含量限度范围,实现质控指标“定得准”,为实现中药质控标准“关联药效,量而又准,可控可评”的愿景提供思路和技术参考。本文以临床常用且药效物质相对明确的人工牛黄为模式药,抗真菌(白色念珠菌Candida albicans)作用为药效模型,初步验证该模式的科学性和可行性。主要结果与结论如下：一、牛黄及其代用品的主要成分含量波动较大,质量差异明显采用液相色谱法对40批牛黄及其代用品进行化学分析,发现其中6种胆汁酸类成分(牛黄胆酸钠、胆酸、熊去氧胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸)的含量变异较大：13批天然牛黄中6种胆汁酸总含量的变异系数为62.44%～222.56%,其中熊去氧胆酸含量的变异系数最大；20批人工牛黄中6种胆汁酸总含量的变异系数为63.27%～122.73%,其中猪去氧胆酸含量的变异系数最大。该结果提示,市售牛黄及其代用品主要化学成分含量波动较大,质量差异明显,牛黄的质量控制指标和标准尚需进一步提升和优化。二、化学-生物指纹图谱联用可有效提高对牛黄及其代用品的鉴别效果(1)采用液相色谱法建立了天然牛黄、人工牛黄、体内培植牛黄、体外培育牛黄和伪牛黄五类样品的化学指纹图谱,相似度分析结果显示,90%样品的相似度介于0.6～0.9之间。对化学指纹图谱进行主成分分析结果显示,所有样品被区分为四组,大部分样品能根据其品种和来源被较好的区分和鉴别,但是部分天然牛黄与体外培育牛黄、人工牛黄样品之间仍有交叉。(2)采用微量量热法测定了40批样品作用于5种生物模型(金黄色葡萄球菌、青春双歧杆菌、大肠杆菌、痢疾杆菌和白色念珠菌)的生物热活性指纹图谱,结果显示白色念珠菌对样品最敏感,为优选的生物模型。对白色念珠菌的生物热活性指纹图谱进行主成分分析结果显示,所有样品被区分为五类,大部分样品能根据其品种和来源被较好的区分和鉴别,但是部分天然牛黄与人工牛黄和体外培育牛黄、人工牛黄与体内培植牛黄样品之间仍有交叉。(3)联合化学指纹图谱和白色念珠菌的生物热活性指纹图谱,可将所有样品分为五组,其中38批样品能被有效区分和鉴别,只有2批人工牛黄与伪品交叉,不能被鉴别。该结果提示,通过化学-生物指纹图谱联用对40批牛黄及其代用品的鉴别效果明显高于分别通过化学指纹图谱和生物热活性指纹图谱对样品的鉴别效果。以上结果表明,化学-生物指纹图谱联合分析,可显著提高对牛黄及其代用品的鉴别效果,在牛黄等名贵珍稀中药材的真伪鉴定等方面具有较好的应用前景。三、通过敲出策略,初步实现人工牛黄抗真菌关键药效物质的快速辨识1.薄层层析法分离人工牛黄样品,得到8个目标敲出组分(记为X+)分别为：A+(牛黄胆酸钠)、B+(未知组分)、C+(混合物,组成未鉴定)、D+(熊去氧胆酸)、E+(猪去氧胆酸)、F+(胆酸)、G+(鹅去氧胆酸+去氧胆酸)和H+(混合物,组成未鉴定)。微量量热法评价8个敲出组分对白色念珠菌的抑制活性强弱顺序：H+>G+>E+>C+>F+>A+>B+>D+。未知组分的组成将在下一步工作中阐明。2.8个敲出组分分别对白色念珠菌的抑制率之和(216.78%)是牛黄母液的(36.07%)的6倍,提示这8个敲出组分之间可能存在拮抗作用关系；进一步分析发现,这8个敲出组分与其阴性样品(已从总提物中“敲出”该组分的样品,记为X-)之间均存在拮抗作用关系,拮抗作用的强弱顺序：H+与H->E+与E->G+与G->F+与F->A+与A->C+与C->D+与D->B+与B-3.敲出的8个组分可能为结构相似的一类成分组成的化(混)合物,与白色念珠菌相互作用时,可能竞争相同的作用靶点而发生竞争性拮抗,从而导致成分与成分、组分与组分之间产生拮抗作用关系。目前,对中药中多成分之间的拮抗关系的关注较少,本研究发现了牛黄中多成分或组分间的拮抗作用关系,提示目前人工牛黄的配方可能还需进一步优化,某些拮抗成分或许可以不加入。四、通过敲入策略,初步制定人工牛黄抗真菌药效物质的质量控制标准：1.通过在8个敲出组分的阴性样品中“递增敲入”各组分,并对所得样品进行抗真菌活性评价,得到8个敲出组分的“量-效”关系。2.基于“量-效”关系,得到各敲出组分的最低含量点,定为质量控制的含量下限。初步制定的8个敲出组分的含量下限：组分A+为0.062 mg/mL、组分B+为0.274 mg/mL、组分C+为0.162 mg/mL、组分D+为0.025 mg/mL、组分E+为0.231 mg/mL、组分F+为0.343 mg/mL、组分G+为0.151 mg/mL、组分H+为0.038 mg/mL。3.具拮抗作用的组分的含量越大,反而会降低其它组分及方药整体的活性。基于“量-效”关系得到拮抗组分的最高含量点,定为质量控制的含量上限。8个组分的含量上限：组分A+为0.062 mg/mL、组分B+为0.358 mg/mL、组分C+为0.393 mg/mL、组分D+为0.031 mg/mL、组分E+为0.362 mg/mL、组分F+为0.361 mg/mL、组分G+为0.391 mg/mL、组分H+为0.40 mg/mL。4.对各组分的含量限度范围进行优化,得到8个敲出组分的最优含量点：组分A+为0.062 mg/mL、组分B+为0.35 mg/mL、组分C+为0.375 mg/mL、组分D+为0.025 mg/mL、组分E+为0.30 mg/mL、组分F+为0.35 mg/mL、组分G+为0.375 mg/mL、组分H+为0.35 mg/mL。按照各敲出组分的活性最优含量配比(黄金比例)组合的样品的抗真菌作用比牛黄母液提高了92.21%。该结果提示,开发“源于传统,高于传统”的“组分中药”具有一定的可行性。通过敲出/敲入策略可发现组分之间的相互作用关系和“量-效”关系,为“组分中药”的研制开发提供了新思路和方法。综上所述,本文探索建立了基于成分敲出/敲入的牛黄药效物质辨识和质量控制模式,初步辨识了人工牛黄抗真菌的关键药效物质并制定其含量的限度范围,为阐明人工牛黄的药效物质基础提供了研究思路,也为中药的药效物质辨识和质量控制提供了实用的模式和方法。

全文目录

摘要  3-6
Abstract  6-16
第1章绪论  16-36
  1.中药药效物质辨识和质量控制的必要性  16
  2.现行中药药效物质辨识模式的利与弊  16-19
    2.1 传统的植化分离与辨识模式  17
    2.2 基于药理活性示踪的中药药效物质辨识模式  17-18
    2.3 基于生物膜色谱分析的中药药效物质辨识模式  18
    2.4 基于计算机虚拟筛选的中药药效物质辨识模式  18-19
  3.现行中药质量控制模式的利与弊  19-22
    3.1 感官评价与鉴定模式  19-20
    3.2 化学评价与控制模式  20-21
    3.3 生物评价与控制模式  21-22
  4.基于成分敲出/敲入的中药药效物质辨识与质量控制模式  22-26
    4.1 成分敲出/敲入模式的研究思路与技术路线  23-25
    4.2 成分敲出/敲入研究模式的主要特色和优势  25
    4.3 成分敲出/敲入模式的适用范围  25-26
    4.4 成分敲出/敲入模式需要解决的关键问题  26
  5.本课题的总体研究思路  26-36
    5.1 本课题的研究目的与意义  26
    5.2 选择牛黄为模式药的依据  26-27
    5.3 选择抗菌作用为药效评价模型的依据  27-28
    5.4 选择生物热动力学为药效评价方法的依据  28
    5.5 牛黄的化学和药理研究概述  28-31
    5.6 牛黄的现状分析  31-32
    5.7 牛黄现行质量控制方法存在的问题  32-33
    5.8 研究思路、方案与技术路线  33-36
第2章样品的收集、制备与化学分析  36-57
  1.样品的收集  36-38
  2.供试样品的制备  38-39
  3.化学分析测定方法的选择  39
  4.牛黄及其代用品的多成分含量测定  39-50
    4.1 仪器  39-40
    4.2 试剂  40
    4.3 实验方法  40-41
    4.4 实验结果与讨论  41-50
  5.基于化学指纹图谱分析的牛黄及其代用品的鉴别  50-55
    5.1 仪器  50
    5.2 试剂  50
    5.3 实验方法  50
    5.4 牛黄及其代用品UPLC-ELSD指纹图谱的建立  50-55
  6.本章小结  55-57
第3章基于生物热活性指纹图谱分析的牛黄及其代用品的鉴别  57-92
  1.供试样品溶液的制备  57-58
  2.仪器  58
  3.基于革兰氏阳性细菌生长代谢的生物热活性指纹图谱鉴别牛黄及其代用品  58-71
    3.1 基于金黄色葡萄球菌生长代谢的生物热活性指纹图谱鉴别牛黄及其代用品  58-65
    3.2 基于青春双歧杆菌生长代谢的生物热活性指纹图谱鉴别牛黄及其代用品  65-71
  4.基于革兰氏阴性细菌生长代谢的生物热活性指纹图谱鉴别牛黄样品及其代用品  71-83
    4.1 基于大肠杆菌生长代谢的生物热活性指纹图谱鉴别牛黄及其代用品  71-77
    4.2 基于痢疾杆菌生长代谢的生物热活性指纹图谱鉴别牛黄及其代用品  77-83
  5.基于真菌生长代谢代谢的生物热活性指纹图谱鉴别牛黄及其代用品  83-89
    5.1 基于白色念珠菌生长代谢的生物热活性指纹图谱鉴别牛黄及其代用品  83-89
  6.化学-生物指纹图谱联用鉴别牛黄及其代用品  89-90
  7.本章小结  90-92
第4章 "谱-效"关系研究辨识牛黄的抗真菌成分  92-99
  1.牛黄及其代用品化学指纹图谱共有峰的峰面积  93-94
  2.牛黄及其代用品抑制白色念珠菌生长代谢的生物活性  94-95
  3."谱-效"关系辨识牛黄的抗真菌成分  95-96
  4.本章小结  96-99
第5章基于成分敲出的人工牛黄抗真菌药效物质辨识  99-119
  1.仪器  100-101
  2.供试样品母液的制备  101
  3.目标组分的敲出  101-104
    3.1 材料  102
    3.2 薄层色谱条件  102
    3.3 方法  102
    3.4 结果与讨论  102-104
  4.目标敲出组分的鉴定  104-107
    4.1 仪器  104
    4.2 试剂  104
    4.3 UPLC-ELSD法鉴定各目标敲出组分  104-107
  5.目标敲出组分的抗真菌作用评价  107-112
    5.1 仪器  107
    5.2 材料  107-108
    5.3 方法  108
    5.4 结果与讨论  108-112
  6.各目标敲出组分之间的相互作用关系  112-114
  7.人工牛黄抗真菌药效组分的辨识  114-116
  8.本章小结  116-119
第6章基于成分敲入的牛黄质量控制研究  119-131
  1.仪器  121
  2.材料  121
  3.方法  121-122
  4.结果与讨论  122-129
    4.1 目标组分敲入的样品作用下白色念珠菌生长代谢的生物热活性指纹图谱  122-123
    4.2 目标组分敲入样品的抗白色念珠菌作用评价  123-125
    4.3 目标敲入组分抗白色念珠菌作用"量-效"关系的建立  125-127
    4.4 人工牛黄中各目标组分抗真菌作用含量限度标准的制定  127-129
    4.5 人工牛黄抗真菌药效物质的最佳组合及黄金比例的确定  129
  5.本章小结  129-131
第7章抗真菌人工牛黄"组分中药"的初步研究  131-137
  1.仪器  131
  2.材料  131-132
  3.方法  132
  4.结果与讨论  132-135
    4.1 人工牛黄中各目标敲出组分不同含量配比的样品作用下白色念珠菌生长代谢的生物热活性指纹图谱  132-133
    4.2 人工牛黄中各目标敲出组分不同含量配比组合样品的抗真菌作用评价  133-135
  5.本章小结  135-137
第8章结语与展望  137-147
  1.主要研究结果和结论  138-143
  2.存在的问题及建议  143-145
  3.前景与展望  145-147
    3.1 成分敲出/敲入模式的应用前景  145-146
    3.2 中药质量控制模式的前景与展望  146-147
参考文献  147-158
在读期间公开发表的学术论文及参编论著  158-160
致谢  160-162

基于成分敲出/敲入的中药（牛黄）药效物质辨识和质量控制模式的初步研究

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