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新疆穴居狼蛛毒素分子多样性和功能研究

作　者: 张勇群
导　师: 梁宋平
学　校: 湖南师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 新疆穴居狼蛛 cDNA文库 表达序列标签(EST) 粗毒 表达与纯化
分类号: Q51
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
下　载: 64次
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内容摘要


新疆穴居狼蛛是在我国新疆发现的一种有毒蜘蛛。它的毒液由许多具有不同生物活性物质组成。为了更好地开发利用该生物资源,阐明新疆穴居狼毒素分子多样性及其遗传进化机制是非常重要的。我们取新疆穴居狼蛛的毒腺建立cDNA文库,随机挑取单克隆进行测序,得到833个高质量的表达序列标签。这些表达序列标签去冗余后,得到331个唯一序列,其中包括271个单拷贝序列和60个多拷贝重叠序列。其中,蜘蛛毒素基因有223个,包括42个族和181个单一序列,占整个转录组的69.1%;与通常细胞蛋白有关的基因95个,包括18个重叠群和77个单一序列,占整个转录组的17.3%。另外还有13.6%没有匹配到与数据相似的序列或者相似性非常低。序列提交到GenBank,序列收录号为EU925924-EU926146和EU247110-EU247223。在所得的新疆穴居狼蛛毒腺cDNA文库中,共获得576个毒素多肽,去冗余后可得223条全长的毒素前体（含有信号肽,富含酸性氨基酸残基的中间肽和成熟肽）。将拥有相同胱氨酸框架且丰度最高的序列归为一类,其他归为第二类,分别用MEGA3.1构建进化树。结果显示,根据预测的成熟肽的半胱氨酸的排列方式文库中的毒素前体可以分为六个超家族,分别为超家族Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ和Ⅵ。另一方面,对普通细胞蛋白相关的转录子进行的基因注释揭示了一些新的可能的毒素成分和毒囊重要细胞生理过程的相关成分,比如蛋白翻译后修饰,细胞运动,蛋白质合成,能量供应等等。新疆穴居狼蛛毒腺的转录组分析和基因的注释展示了毒腺这个特化的产毒器官中的生理概况。蜘蛛粗毒中富含生物活性物质,尤其以多肽类成分为主。在新疆穴居狼蛛粗毒中我们分离鉴定了一种新的细胞裂解肽,命名为LSTX-A1,其分子量为7335.33 Da,含有65个氨基酸残基,且羧基端残基酰胺化。文中我们研究了LSTX-A1的细胞裂解作用,结果显示,在100μM浓度引起42%红细胞溶血。同时LSTX-A1具有抗肿瘤作用,能抑制HeLa细胞的增殖,其IC50剂量为22μM。随着环境的改变,蜘蛛的种类和数量越来越少,仅靠天然资源远不能满足对毒素的全面研究和开发利用的需要。采用表达质粒pVT102U/α在酿酒酵母S78中表达HWTX-XI的产率达到每升12.5mg。为了探讨这个表达系统是否能成一个表达蜘蛛毒素的通用系统,我们克隆23个编码新疆穴居狼蛛毒素样多肽的基因。最后,成功的表达出6个含有4对或5对二硫键的毒素基因。对这些表达产物进行了初步的功能研究,遗憾的是还没有找到生物学活性。综上所述,利用分子生物学、生物信息学、生物化学、质谱和膜片钳等技术,我们对新疆穴居狼蛛毒腺的转录组进行了研究,分离鉴定了一种新的细胞裂解肽,克隆了一批新基因,成功表达了6个毒素多肽,为进一步研究毒素的功能打下了基础。

全文目录


中文摘要  3-5
ABSTRACT  5-10
第一章 蜘蛛毒素的多样性研究进展  10-49
  1.1 蜘蛛毒素分子的一级结构多样性  11-27
    1.1.1 含有三对二硫键的蜘蛛肽类毒素  13-18
    1.1.2 含有四对二硫键的蜘蛛肽类毒素  18-22
    1.1.3 含有五对二硫键的蜘蛛肽类毒素  22-24
    1.1.4 含有六对二硫键的蜘蛛肽类毒素  24-25
    1.1.5 含有七对二硫键的蜘蛛肽类毒素  25-26
    1.1.6 含有奇数半胱氨酸残基的蜘蛛肽类  26-27
  1.2 蜘蛛毒素的空间结构多样性  27-33
  1.3 蜘蛛毒素的功能多样性  33-44
    1.3.1 神经毒素  33-39
    1.3.2 非神经毒素  39-44
  1.4 蜘蛛毒素分子多样性的进化机制  44-49
第二章 新疆穴居狼蛛转录组学研究  49-93
  2.1 前言  49-51
  2.2 材料  51-56
  2.3 方法  56-68
  2.4 结果与分析  68-84
  2.5 讨论  84-93
第三章 新疆穴居狼蛛毒素结构和功能研究  93-112
  3.1 前言  93-95
  3.2 材料与方法  95-102
  3.3 结果  102-109
  3.4 讨论  109-112
第四章 新疆穴居狼蛛毒素基因的真核表达与功能分析  112-137
  4.1 前言  112-113
  4.2 材料与方法  113-124
  4.3 结果  124-134
  4.4 讨论  134-137
主要研究结果与进一步研究设想  137-139
  主要研究结果  137-138
  进一步研究设想  138-139
参考文献  139-157
附录一  157-159
附录二  159-189
附录三  189-224
论文发表情况  224-225
致谢  225-227

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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 蛋白质
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