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坎氏弧菌TLH溶血素基因的克隆表达、蛋白纯化及活性研究

作　者: 孙婧
导　师: 张晓华
学　校: 中国海洋大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 坎氏弧菌 溶血素 表达 蛋白纯化 溶血活性
分类号: S941
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


近年来,随着海水养殖业的不断发展,养殖病害呈加重之势,成为制约养殖渔业发展的首要问题之一。在养殖病害种类中以细菌性病害最为严重,其中又以弧菌属(Vibrio)的病原菌危害最大。弧菌病害流行面广、传播快、发病率和死亡率高,因而成为海水养殖病害研究的重点。坎氏弧菌(Vibrio campbellii)是一种革兰氏阴性、兼性厌氧的海洋细菌,是海水养殖动物的重要条件致病菌,可以引起养殖对虾暴发红腿病,鲍鱼患脓毒败血症等,该菌还与螺类和养殖幼鱼的发病相关,给海水养殖业造成了巨大的经济损失。由于对坎氏弧菌致病性的认识较晚,对其致病机理的研究还不够深入。溶血素是致病弧菌中分布最为广泛的毒素之一,在病原弧菌的感染过程中发挥着多种重要作用。不同病原弧菌产生的溶血素虽然都具有溶血活性,但它们氨基酸序列、溶血活性及作用机理却有所不同。前期研究发现,坎氏弧菌中含有与哈维氏弧菌VHH溶血素基因序列非常相似的TLH溶血素基因,其核苷酸序列与哈维氏弧菌VIB645的vhhA和vhhB的相似性分别为79.81%和79.73%,其氨基酸序列与VHH溶血素相似性为85%,且这两种溶血素均在147-406位氨基酸处有一个脂酶结构域(Lipase_GDSL),推测这一类溶血素是磷脂酶。本研究克隆表达了坎氏弧菌的tlh基因,重组表达后,利用Ni-柱进行纯化；分析了纯化的TLH溶血素的溶血活性以及该溶血素受温度、pH和金属离子的影响,并进一步研究了TLH溶血素对斑马鱼的致病性。本研究设计了一对特异性引物,自坎氏弧菌基因组上扩增出tlh溶血素基因(1254bp)；将PCR产物连接到表达载体pET-26b(+),构建了坎氏弧菌TLH溶血素基因的重组表达质粒pET26b(+)/tlh,并转化大肠杆菌BL21(DE3)；加入终浓度为1mM的IPTG诱导重组菌表达带有6个组氨酸标签的TLH融合蛋白。诱导后的重组大肠杆菌及其培养上清液在新鲜牙鲆血平板16℃过夜及卵磷脂平板37℃过夜培养,培养结果显示诱导后的菌体及上清液分别具有溶血活性及磷脂酶活性。SDS-PAGE分析显示,该溶血素在重组大肠杆菌中能够大量诱导表达,分子量约为42 kDa。利用Ni琼脂糖亲和层析柱对重组的坎氏弧菌TLH溶血素进行纯化,纯化的TLH溶血素在SDS-PAGE电泳图上为单一蛋白带；利用Bradford法绘制标准蛋白曲线,得到纯化的TLH溶血素的浓度为0.41 mg/mL。溶血素活性实验表明,纯化的TLH溶血素具有较强的溶血活性(溶血圈直径为16 mm)及磷脂酶活性(浑浊内圈直径为11mm,透明外圈直径为15mm)。TLH溶血素溶血活力的最适温度为37℃；温度稳定性检测显示,在小于37℃时较稳定,45℃下孵育30min其活力损失50%,55℃下孵育30 min其活力损失75%,75℃下孵育30 min即完全丧失溶血活力,证明坎氏弧菌TLH溶血素是热不稳定性溶血素。TLH溶血素的最适pH为6,在pH为5和7时,只有50%的活力,且TLH溶血素在pH 5-10较稳定,pH大于10或小于5时都会导致其稳定性迅速下降。本实验中10种金属离子(Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Mn2+, Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+和Ba2+)对坎氏弧菌TLH溶血素溶血活力的影响结果显示,一价金属离子如Na+、K+对溶血活性几乎没有影响,而部分二价金属离子如Ca2+、Co2+会导致溶血活性降低,这说明有一些二价金属离子可以抑制坎氏弧菌TLH溶血素的溶血活性。致病性研究显示,TLH溶血素感染健康斑马鱼后,斑马鱼出现胸腹腔出血肿胀及全身性出血现象,并对斑马鱼有致死作用,半数致死量LD50为2.158μg／g鱼。本研究结果对阐明坎氏弧菌的致病机理及基因工程疫苗开发有重要意义。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-13
前言  13-31
  1 海水养殖动物细菌性病害的研究概况  13-16
    1.1 海水养殖概况  13-14
    1.2 海水养殖细菌性病害  14-16
  2 病原弧菌的毒力因子  16-27
    2.1 黏附因子(Adhesions)  17
    2.2 铁吸收系统(Iron uptake system)  17-18
    2.3 荚膜(Capsule)  18
    2.4 外膜蛋白(Outer membrane protein,OMP)  18-19
    2.5 胞外蛋白酶(Extracellular protease)  19
    2.6 脂多糖(LiPopolysaccharide,LPS)  19-20
    2.7 磷脂酶(Phospholipase)  20-22
    2.8 溶血素(Hemolysin)  22-27
      2.8.1 副溶血弧菌的耐热直接溶血素(TDH)及其相关溶血素  24-25
      2.8.2 霍乱弧菌的El Tor溶血素(HlyA)及其相关溶血素  25-26
      2.8.3 副溶血弧菌的热不稳定性溶血素(TLH)及其相关溶血素  26-27
      2.8.4 副溶血弧菌的热稳定性溶血素(δ-VPH)及其相关溶血素  27
      2.8.5 霍乱弧菌01的一种溶血素(HLX)及其相关溶血素  27
  3 坎氏弧菌的研究概况  27-29
  4 本论文的研究目的和意义  29-31
1 材料与方法  31-46
  1.1 菌株与质粒  31-32
  1.2 实验动物  32
  1.3 培养基  32-33
  1.4 主要试剂与仪器  33
  1.5 TLH溶血素基因的克隆及表达载体的构建  33-38
    1.5.1 坎氏弧菌VIB 285基因组DNA的提取  33-34
    1.5.2 引物设计及合成  34
    1.5.3 表达载体pET26b(+)质粒DNA提取  34-35
    1.5.4 坎氏弧菌VIB 285溶血素基因tlh的PCR扩增  35-36
    1.5.5 pET-26b(+)/tlh表达载体的构建  36-37
    1.5.6 大肠杆菌JM109和BL21(DE3)的感受态细胞制备  37-38
    1.5.7 重组质粒的转化  38
    1.5.8 重组质粒pET-26b(+)/tlh的鉴定  38
  1.6 TLH溶血素在大肠杆菌BL21(DE3)中的诱导表达  38-40
    1.6.1 TLH溶血素在大肠杆菌BL21(DE3)中的诱导表达  38-39
    1.6.2 坎氏弧菌TLH溶血素的SDS-PAGE检测  39-40
    1.6.3 诱导表达重组菌的溶血活性检测  40
    1.6.4 诱导表达重组菌的磷脂酶活性检测  40
  1.7 TLH溶血素表达及纯化  40-43
    1.7.1 重组菌BL21(DE3)/pET-26b(+)/tlh的诱导表达  40-41
    1.7.2 从菌体中纯化TLH溶血素  41
    1.7.3 Ni琼脂糖亲和柱亲和层析  41
    1.7.4 Ni琼脂糖亲和层析柱的处理与再生  41-42
    1.7.5 SDS-PAGE检测纯化后的溶血素  42
    1.7.6 蛋白质含量侧定  42-43
  1.8 TLH溶血素的活性研究  43-45
    1.8.1 TLH溶血素的溶血活性检测  43
    1.8.2 TLH溶血素的磷脂酶活性检测  43
    1.8.3 TLH溶血素的溶血活力测定  43-44
    1.8.4 温度对TLH溶血素溶血活力的影响  44
    1.8.5 pH对TLH溶血素溶血活力的影响  44
    1.8.6 金属离子对TLH溶血素溶血活力的影响  44-45
  1.9 TLH溶血素对斑马鱼的致病性  45-46
2 结果与分析  46-56
  2.1 pET-26b(+)/tlh表达载体的构建及鉴定  46-47
    2.1.1 坎氏弧菌VIB 285溶血素基因tlh的PCR扩增  46
    2.1.2 pET-26b(+)/tlh表达载体的构建及鉴定  46-47
  2.2 坎氏弧菌TLH溶血素的诱导表达  47-48
    2.2.1 重组菌的溶血活性检测  47-48
    2.2.2 重组菌的磷脂酶活性检测  48
  2.3 坎氏弧菌TLH溶血素的表达及纯化  48-50
    2.3.1 坎氏弧菌TLH溶血素纯化  48-49
    2.3.2 纯化的坎氏弧菌TLH溶血素蛋白质含量的测定  49-50
  2.4 坎氏弧菌TLH溶血素的活性研究  50-54
    2.4.1 坎氏弧菌TLH溶血素的溶血活性测定  50-51
    2.4.2 坎氏弧菌TLH溶血素的磷脂酶活性测定  51
    2.4.3 温度对坎氏弧菌TLH溶血素溶血活力的影响  51-52
    2.4.4 pH对坎氏弧菌TLH溶血素溶血活力的影响  52-53
    2.4.5 金属离子对坎氏弧菌TLH溶血素溶血活力的影响  53-54
  2.5 TLH溶血素对斑马鱼的致病性  54-56
3 讨论  56-59
4 结论  59-60
参考文献  60-74
附录Ⅰ V.campbellii VIB285全序列  74-75
附录Ⅱ 溶液配方  75-77
附录Ⅲ 攻读硕士学位期间发表的文章  77-78
致谢  78

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 鱼病学
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