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TRAIL-receptor2mAb介导的多功能靶向纳米载药系统的构建及其抗恶性黑素瘤作用研究

作　者: 丁宝月
导　师: 高申；丁雪鹰
学　校: 第二军医大学
专　业: 药剂学
关键词: 恶性黑素瘤 DR5单克隆抗体 达卡巴嗪 MPEG-PLA 载药纳米粒 靶向纳米载药系统 凋亡
分类号: R96
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


恶性黑素瘤(malignant melanoma,MM),简称恶黑,是一种来源于黑色素细胞的恶性程度很高的肿瘤,易血行转移、死亡率高,而且近年来,恶黑的发病率有明显上升的趋势,包括原先发病率较低的地区也是如此,至今仍缺乏有效地治疗手段。目前,临床上治疗转移性恶性黑色素瘤的主要手段仍然是在术后予以全身辅助的化学治疗,但目前用于MM的首选化疗药物(达卡巴嗪dacarbazine,DTIC)显效率也只有20%。且剂型单一,只有普通注射粉针剂,存在毒副作用大、靶向性差、用药顺应性差等缺点,因此急需对其化疗方法和剂型进行改进。有研究发现黑素瘤细胞表面高表达DR4或DR5,因此将DR4或DR5的激动型抗体DR4或DR5 mAb用于MM的免疫治疗具有良好的应用前景。本课题主要从如何更好地将化疗和免疫治疗相结合,制得高效低毒的主动靶向给药系统用于恶性黑素瘤治疗方面进行相关探索。为了改进恶性黑素瘤的治疗方法,提高疗效,降低毒副作用。在本课题研究中,采用对正常细胞无毒副作用、对MM ( MM细胞表面高表达DR5)具有高特异性和高选择性且自身具有抗肿瘤活性的的抗DR5单克隆抗体(DR5 mAb)为靶头,以达卡巴嗪(DTIC)为模型药物,聚乙二醇修饰的聚乳酸纳米微粒(MPEG-PLA NPs)为递药系统制备兼具化疗和免疫治疗作用的主动靶向免疫纳米微粒,并对其性质及体内外生物性能进行了考察。本文主要从以下几部分进行研究:第一部分,本文以DTIC为模型药物,MPEG-PLA为载体材料,采用超声复乳法制备了DTIC纳米粒(DTIC-NPs),通过单因素考察和正交设计优化制备纳米粒的处方工艺,确定制备纳米粒最优条件。然后以最佳工艺制得DTIC-NPs,并对其形貌、粒径、Zeta电位、表面元素、载药量、包封率、药物体外释放行为进行了考察。粒径电位分析仪及透射电镜测定结果显示,制得的纳米粒外形圆整,表面光滑,纳米粒平均粒径在144.2±7.8 nm左右,粒径分布均匀。其Zeta电位绝对值在-32.1±5.4 mV左右,静电稳定性好。XPS光电能谱仪空载纳米粒表面含有N元素,说明纳米微粒表面包裹有一层HSA,为DTIC-NPs的进一步功能化提供了条件。所制得的DTIC-NPs包封率为71.06±2.63 %、载药量为15.2±0.4μg/mg,DTIC的体外释放可分三个阶段:突释阶段、稳定释放阶段和加速释放阶段。在突释阶段中,纳米释放药量在4h时约为20%,纳米微粒释药在扩散阶段释药保持稳定增长,24h时释药量在40%左右,在72h时可达到81%左右,在最后阶段为纳米微粒MPEG-PLA降解,累积释药量达到91 %左右。第二部分,采用碳二亚胺法,将对正常细胞无毒副作用、将对MM具有高特异性和高选择性且自身具有促肿瘤细胞凋亡活性的DR5 mAb偶联到以上所构建载药纳米粒表面,设计了一种以具生物活性的抗体为靶头的靶向免疫纳米载药系统(DTIC-NPs -DR5 mAb),并对其形貌、粒径分布等进行了表征,DTIC-NPs-DR5 mAb平均粒径为166.0±8.1 nm, Zeta电位值为-36.8±3.2mV。通过双荧光标记法和Micro BCA蛋白含量测定法对单抗靶头是否顺利连接到纳米粒表面进行了定性验证和定量测定,计算得到连接在纳米粒表面的DR5 mAb数量为12.8±2.4μg DR5 mAb/mg NPs,抗体连接效率大约为43%左右。所构建的纳米靶向载药系统DTIC-NPs-DR5 mAb保持原DTIC-NPs缓释药物的特点,具有双重活性功能,即免疫导向和缓释药物,有利于提高肿瘤局部药物浓度。第三部分,采用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜考察了靶纳米载药系统对靶细胞人恶性黑素瘤细胞A375的特异性结合、结合效率和摄取效果。用MTT法考察了靶向纳米粒A375细胞的抑制增殖作用和促凋亡作用,还考察了载体系统的安全性。流式测定和激光共聚焦结果表明, DTIC-NPs -DR5 mAb能跟A375细胞特异性结合,在5 min内就已经结合在细胞表面,结合效率较高,30 min后纳米粒已明显进入细胞内,入胞效果良好。MTT实验表明DTIC-NPs -DR5 mAb对A375细胞有良好的抑制增殖作用,其对A375细胞的抑制增殖作用和促凋亡作用显著强于其它对照组,细胞生存率仅为19.3±3.6%,DTIC-NPs-DR5 mAb作用组的A375细胞凋亡率为58.5±5.0%,而DTIC作用组的A375细胞凋亡率只有31.7±3.9%。通过MTT实验,我们发现本实验制得的递释系统MPEG-PLA-NPs和MPEG-PLA-NPs-DR5 mAb对正常细胞的毒性不大,在浓度高达2.2 mg/ml时对于细胞活力均没有受到显著影响,细胞活力均保持在大约80%以上,而且接了靶头的MPEG-PLA-NPs-DR5 mAb跟未接靶头的MPEG-PLA-NPs相比对正常细胞杀伤力并没有明显差异,说明该靶向递释系统(MPEG-PLA-NPs-DR5 mAb)具有良好的安全性,是一种安全的药物载体。第四部分,我们通过人恶性黑素瘤肿瘤移植裸鼠模型的建立,考察了靶向纳米粒的抗肿瘤效果及体内安全性。参比各种治疗因子,考察并评价了DTIC-NPs-DR5 mAb在体内的非特异性毒性情况以及对DR5高表达的黑素瘤的治疗情况。裸鼠的血常规及肝肾功能检测结果均表明,DTIC-NPs-DR5 mAb毒性较小,比起DTIC原药,MPEG-PLA对DTIC的包裹及抗体靶头的导向作用可以有效地减与正常组织细胞对DTIC的非特异性摄取,减小了DTIC在体内的非特异性毒性。在裸鼠的体内治疗试验中,DTIC-NPs-DR5 mAb对高表达DR5的恶性黑素瘤具有明确疗效,对肿瘤的生长产生了明显抑制作用,最终肿瘤平均体积为241.86±84.74 mm3 (PBS空白对照为1308.12±182.73 mm3)。综上所述,本课题成功构建了本身具有促靶细胞凋亡活性的DR5 mAb为靶头的主动靶向给药系统DTIC-NPs-DR5 mAb,可将化疗和免疫治疗有效结合,从内源性和外源性两条途径促进靶细胞凋亡,可起双重和协同治疗作用。体内外实验结果证明其靶向效率高、具有很好的抗肿瘤活性,大大提高了疗效、且毒副作用较低,是一种安全有效的新型抗肿瘤靶向制剂。通过该研究可为MM及其他肿瘤的化疗和靶向生物治疗提供相关的研究方法和思路,也可为今后靶向药物控释系统的设计提供试验资料和理论依据。

全文目录


摘要  11-14
ABSTRACT  14-18
缩略词表  18-21
前言  21-29
第一部分 载达卡巴嗪的纳米递释系统的构建、优化及评价  29-52
  1 仪器与材料  30-31
    1.1 仪器  30
    1.2 材料和试剂  30-31
  2 实验方法  31-37
    2.1 DTIC 含量测定分析方法的建立与评价  31-32
      2.1.1 色谱条件  31
      2.1.2 标准曲线的建立  31
      2.1.3 精密度  31
      2.1.4 专属性  31-32
      2.1.5 回收率  32
    2.2 载达卡巴嗪纳米粒(DTIC-NPs) 的制备工艺和评价方法  32-34
      2.2.1 NPs 的制备方法  32-33
      2.2.2 NPs 粒径和ZETA 电位测定  33
      2.2.3 NPs 形态观察  33
      2.2.4 NPs 表面XPS 光电能谱分析  33-34
      2.2.5 载药量和包封率的测定  34
    2.3 制备载DTIC 纳米粒的处方工艺优化  34-36
      2.3.1 单因素考察  35
        2.3.1.1 超声功率的影响  35
        2.3.1.2 初乳/外水相体积比的影响  35
        2.3.1.3 MPEG-PLA 浓度的影响  35
        2.3.1.4 外水相HSA 浓度的影响  35
      2.3.2 正交试验  35-36
    2.4 最佳处方工艺验证  36
    2.5 递药系统DTIC-NPs 体外释放性能的测定  36-37
    2.6 数据处理和统计方法  37
  3 实验结果  37-48
    3.1 DTIC 含量测定分析方法的建立与评价  37-39
    3.2 DTIC-NPs 的表征  39-41
    3.3 单因素考察结果  41-43
    3.4 正交试验结果  43-45
    3.5 最佳处方工艺验证  45-47
    3.6 载DTIC 纳米粒的体外释放行为  47-48
  4 讨论  48-50
    4.1 DTIC-NPs 的制备  48
    4.2 DTIC-NPs 的制备工艺优化及验证  48-49
    4.3 DTIC-NPs 的体外释放行为  49-50
  5 小结  50
  参考文献  50-52
第二部分DTIC-NPs-DR5 mAb 靶向递释系统的构建、评价及性能考察  52-69
  1 仪器和材料  53-54
    1.1 仪器  53
    1.2 材料与试剂  53-54
  2 实验方法  54-58
    2.1 DR5 mAb 含量测定方法的建立  54-55
      2.1.1 Micro BCA 法测定偶联反应上清液中DR5 mAb 含量标准曲线的绘制  54
      2.1.2 纳米粒上DR5 mAb 含量测定方法评价  54-55
      2.1.3 纳米粒上DR5 mAb 含量的测定方法  55
    2.2 靶向纳米粒DTIC-NPs-DR5 mAb 的构建  55-56
      2.2.1 DTIC-NPs 的制备  55
      2.2.2 DR5 mAb 与纳米粒偶联物的制备  55-56
    2.3 DTIC-NPs-DR5 mAb 的表征  56
      2.3.1 DTIC-NPs-DR5 mAb 粒径与ZETA 电位测定  56
      2.3.2 DTIC-NPs-DR5 mAb 形态观察  56
    2.4 验证DR5 mAb 与纳米粒偶联  56-57
      2.4.1 荧光纳米粒的制备  56
      2.4.2 荧光显微镜定性验证实验  56-57
      2.4.3 流式细胞仪定性验证实验  57
    2.5 纳米粒上DR5 mAb 含量的测定  57
    2.6 DTIC-NPs-DR5 mAb 体外释药行为的测定  57-58
    2.7 数据处理和统计方法  58
  3 实验结果  58-64
    3.1 DR5 mAb 含量测定方法的建立与评价  58-61
    3.2 DTIC-NPs-DR5 mAB 的表征  61
    3.3 验证DR5 mAb 与纳米粒偶联  61-63
    3.4 纳米粒上DR5 mAb 的含量  63
    3.5 DTIC-NPs-DR5 mAb 的体外释放行为  63-64
  4 讨论  64-65
    4.1 DTIC-NPs-DR5 mAb 的构建与验证  64
    4.2 DTIC-NPs-DR5 mAb 的表征  64-65
    4.3 DR5 mAb 含量的测定  65
    4.5 DTIC-NPs-DR5 mAb 的体外释放行为  65
  5 小结  65-66
  参考文献  66-69
第三部分DTIC-NPs-DR5 mAb靶向纳米载药系统的体外生物功能评价  69-85
  1 仪器和材料  69-71
    1.1 仪器  69-70
    1.2 材料与试剂  70-71
  2 实验方法  71-74
    2.1 细胞的培养  71
    2.2 DTIC-NPs-DR5 mAb 的靶向功能验证实验  71-72
      2.2.1 流式细胞仪验证DR5 生物活性  71
      2.2.2 DTIC-NPs-DR5 mAb 的细胞内吞验证实验  71-72
    2.3 DTIC-NPs-DR5 mAb 对MM 细胞株的杀伤和抑制增殖作用及其安全性考察  72-73
    2.4 靶向纳米粒的促MM 细胞凋亡效果评价  73-74
    2.5 数据处理和统计方法  74
  3 实验结果  74-81
    3.1 DTIC-NPs-DR5 mAb 的靶向功能验证  74-77
    3.2 递释系统的安全性及靶向载药递释系统DTIC-NPs-DR5 mAb 对MM 细胞株的杀伤作用  77-79
    3.3 DTIC-NPs-DR5 mAb 的促MM 细胞凋亡效果  79-81
  4 讨论  81-83
    4.1 DTIC-NPs-DR5 mAb 的靶向功能验证  81-82
    4.2 递释系统的安全性及靶向载药递释系统DTIC-NPs-DR5 mAb 对MM 细胞株的杀伤作用  82-83
    4.3 DTIC-NPs-DR5 mAb 的促MM 细胞凋亡效果  83
  5 小结  83
  参考文献  83-85
第四部分DTIC-NPs-DR5 mAb 体内靶向特性及抗肿瘤效果、安全性评价  85-101
  1 仪器与材料  85-87
    1.1 仪器  85-86
    1.2 材料与试剂  86-87
    1.3 实验动物  87
  2 实验方法  87-89
    2.1 裸鼠人恶性黑素瘤肿瘤移植模型的建立  87
    2.2 靶向纳米粒在动物体内动态分布及靶向性检测  87-88
    2.3 抗肿瘤治疗  88-89
      2.3.1 动物分组  88
      2.3.2 病理组织的免疫组化检测  88-89
        2.3.2.1 微血管密度( MVD) 测定  88-89
        2.3.2.2 凋亡指数( AI )测定  89
      2.3.3 动物血常规及肝、肾功能检测  89
      2.3.4 组织学观察  89
    2.4 数据处理和统计方法  89
  3 实验结果  89-97
    3.1 靶向纳米粒在动物体内的动态分布及特异性分布  89-91
    3.2 对BALB/C 裸鼠人黑素瘤移植肿瘤模型的抗肿瘤效果  91-93
    3.3 治疗前后肿瘤组织血管计数及凋亡指数的变化  93-94
    3.4 不良反应  94-95
    3.5 组织学观察结果  95-97
  4 讨论  97-99
    4.1 动物体内动态分布  97
    4.2 DTIC-NPs-DR5 mAb 对恶性黑素瘤的体内治疗情况  97-98
    4.3 DTIC-NPs-DR5 mAb 的安全性评价  98-99
  5 小结  99
  参考文献  99-101
全文总结  101-104
主要创新点  104-105
后续工作及展望  105-106
综述 肿瘤的主动靶向给药系统研究现状及展望  106-126
  1 受体介导内化的肿瘤靶向给药系统  106-113
    1.1 表皮生长因子受体  107-108
    1.2 转铁蛋白受体  108-109
    1.3 唾液酸糖蛋白受体  109-110
    1.4 低密度脂蛋白受体  110
    1.5 叶酸受体  110-112
    1.6 胰岛素样生长因子受体  112
    1.7 血管内皮生长因子受体  112-113
    1.8 白介素受体  113
  2 抗体介导的肿瘤靶向给药系统  113-118
    2.1 单克隆抗体  114-116
    2.2 免疫脂质体  116
    2.3 单抗偶联物  116-118
      2.3.1 化学免疫偶联物  116-117
      2.3.2 生物毒素偶联物  117-118
      2.3.3 放射性元素偶联物  118
  3 前体药物的肿瘤靶向给药系统  118-120
  4 肿瘤主动靶向给药系统存在问题及前景展望  120-121
  参考文献  121-126
科研工作情况简介  126-129
致谢  129

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学
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