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低氧诱导肝癌细胞可塑性的分子机制及与侵袭转移的相关性研究

作　者: 张琳
导　师: 董家鸿
学　校: 第三军医大学
专　业: 外科学
关键词: 低氧诱导因子-1α SNAI1 上皮–间叶转变间叶–上皮转变肝细胞癌侵袭转移重组腺病毒 RNA干扰启动子转录调控
分类号: R735.7
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

研究背景与目的:肝细胞癌(HCC)是威胁人类健康的重大疾病,侵袭转移是其主要生物学特点,也是造成患者主要的死亡原因。尽管近年来,在诊断方法和治疗手段方面取得了长足的进步,但由于侵袭转移的内在机制尚不明确,患者的生存时间仍无明显延长。因此有关侵袭转移的机制研究依然是HCC研究的关键问题。近年来,肿瘤细胞上皮-间叶样转变(EMT)、间叶样-上皮转变(MET)、肿瘤干细胞(CSCs)假说、肿瘤细胞与微环境的相互作用被认为与肿瘤的侵袭转移密切相关,成为探讨肿瘤侵袭转移机制的热点领域。现在认为EMT是实体肿瘤转移的起始环节。当肿瘤细胞发生EMT后,细胞间粘附降低,运动能力增强,利于肿瘤细胞脱离原发病灶,进入周围血管或淋巴管系统,成为肿瘤远处转移的前提。上述过程的逆过程叫做MET,是在形成转移灶过程中,微环境改变后,发生EMT转变的细胞逆转恢复上皮表型,从而有利于肿瘤细胞的定植和增殖,进而形成转移灶。低氧作为实体肿瘤微环境代表因素,也是实体肿瘤进展和治疗过程中普遍存在的现象。研究低氧与肿瘤细胞的相互作用,对探讨微环境对肿瘤侵袭转移的影响具有普遍意义。HCC作为一种在肝炎、肝硬化背景下发生的生长迅速、高转移的恶性肿瘤,无疑是研究低氧对肿瘤细胞影响的理想模型。本课题以低氧能否诱导肿瘤细胞发生EMT/MET转变为切入点,探讨低氧对HCC侵袭转移的影响及其可能的调控机制。研究假说:我们提出“低氧/复氧诱导HCC细胞发生可塑性转变,HIF1α是关键的调控因子”的理论假设。具体而言,即HCC细胞在原发灶由于低氧导致HIF1α稳定表达,通过与SNAI1 启动子区HRE结合,直接上调SNAI1表达,诱导HCC细胞发生EMT转变,利于肿瘤细胞的侵袭转移。当肿瘤细胞到达合适器官或组织,环境氧浓度恢复,导致HIF1α快速降解,解除对SNAI1的作用,从而发生了间叶样转变的细胞重新恢复上皮细胞表型,细胞连接紧密,黏附力增强,运动能力减弱,则利于肿瘤细胞的定植和形成转移灶。HIF-1α在低氧诱导的HCC转变中可能起“枢纽分子”的作用,HIF1α-SNAI1-EMT信号通路可能是材料与方法:一、收集66例临床HCC组织标本并制作组织芯片(TMA),通过免疫组化方法检测HIF1α、HIF2α、SNAI1、twist、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表达,探讨其内在相关性,及其与临床病理因素间的相互关系。二、利用三气低氧培养箱构建体外HCC细胞低氧/复氧模型,采用光镜动态观察、细胞免疫荧光、qPCR、Western blot等方法在细胞形态、mRNA、蛋白水平检测细胞转变相关因子的表达变化。利用流式细胞仪检测细胞周期变化;利用Transwell小室观察细胞侵袭、运动能力的改变;利用平板克隆观察细胞增殖能力的变化。三、利用CoCl2模拟低氧环境,稳定HIF1α的表达,采用光镜动态观察、细胞免疫荧光、qPCR、Western blot的方法在细胞形态、mRNA、蛋白水平检测细胞转变相关因子的表达变化。四、采用分子克隆技术,构建重组HIF1αsiRNA- pSES-HUS质粒载体,并与腺病毒Adeasy骨架质粒重组为Ad-HIF1αsiRNA-pSES-HUS腺病毒载体,用其转染SMMC-7721肝癌细胞,通过qPCR、Western-blot、侵袭实验、运动实验,观察干扰HIF1α对肝癌细胞侵袭、运动能力的影响;五、通过基因转染、基因突变、分子克隆等技术构建系列5’端缺失的PGL3-Basic-SNAI1 Pro质粒及突变体质粒。通过双荧光素酶报告基因检测系统观察SNAI1启动子活性。探讨HIF1α与SNAI1之间的调控关系。结果及结论:1、在临床病理因素分析中发现,HIF1α的异常表达与EMT调控因子SNAI1表达在HCC中的表达明显高于正常肝组织,切显著相关。HIF-1α和SNAI1的表达与患者的预后、肿瘤侵袭转移明显相关。2、成功构建低氧/复氧诱导HepG-2和SMMC-7721肝癌细胞发生可塑性转变体外模型。证实低氧/复氧可诱导HepG-2和SMMC-7721肝癌细胞发生可塑性转变。3、100μM的CoCl2稳定HIF1α可以诱导HepG-2和SMMC-7721肝癌细胞发生可塑性转变。HIF1α可能是低氧/复氧诱导肝癌细胞发生可塑性转变的关键分子。4、分别成功构建了包含重组Ad-HIF1αsiRNA- pSES-HUS 4个腺病毒表达载体。成功筛选出有效的HIF1α干扰序列。干扰内源性HIF1α的表达,能有效抑制CoCl2诱导的SMMC-7721肝癌细胞EMT转变,降低肿瘤细胞的侵袭、运动能力。5、成功构建系列5’端缺失的PGL3-Basic-SNAI1 Pro质粒;成功构建系列5’端缺失含HRE突变体的PGL3-Basic-SNAI1 Pro质粒。通过双荧光素酶报告基因检测系统,证明HIF1α可能通过与SNAI1启动子HRE直接结合,调控细胞发生可塑性转变。6、肿瘤细胞在低氧/复氧状态下发生的细胞可塑性变化,可塑性现象与肿瘤干细胞的分化、去分化之间的关系怎样?可塑性是肿瘤干细胞独有的特点吗?肿瘤干细胞是一群固定的细胞,还是肿瘤细胞发生发展及侵袭转移中动态的过程?这些问题的回答,这将会引领课题更进一步深入研究。

全文目录

英文缩略词表  6-8
英文摘要  8-12
中文摘要  12-15
论文正文低氧诱导肝癌细胞可塑性的分子机制及与侵袭转移的相关性研究  15-145
  前言  15-17
  第一部分 HIFs 与肝细胞癌侵袭转移的临床病理因素分析  17-29
    材料与方法  17-21
    结果  21-26
    讨论  26-28
    结论  28-29
  第二部分低氧/复氧诱导HCC 细胞发生可塑性转变的体外模型建立  29-49
    材料与方法  29-41
    结果  41-46
    讨论  46-48
    结论  48-49
  第三部分 HIF1α诱导HCC 细胞发生可塑性转变  49-58
    材料与方法  49-51
    结果  51-56
    讨论  56-57
    结论  57-58
  第四部分 HIF1αsiRNA 腺病毒载体的构建及干扰实验  58-88
    材料与方法  58-77
    结果  77-85
    讨论  85-87
    结论  87-88
  第五部分 HIF1α调控SNA11 启动子活性的实验研究  88-115
    材料与方法  88-105
    结果  105-113
    讨论  113-114
    结论  114-115
  全文总结  115-116
  致谢  116-118
  照片  118-135
  参考文献  135-145
文献综述低氧微环境、实体肿瘤细胞可塑性、侵袭转移相关性研究  145-162
  参考文献  155-162
博士期间的主要学术成绩  162-163
英文论著一 Oxygen-dependent Plasticity could elucidate the metastasis of hepatocellular carcinoma residues after transarterial chemoembolization  163-170
英文论著二 Oxygen-dependent Plasticity could facilitate solid tumor cells metastasis Hypoxia-inducible factor-1αas one of the key factors  170-178

低氧诱导肝癌细胞可塑性的分子机制及与侵袭转移的相关性研究

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