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豆蔻酰化修饰及质膜结合在烟草小GTP结合蛋白基因NtRab5b转录调控中的作用

作　者: 贺亮亮
导　师: 徐增富
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 遗传学
关键词: BY-2细胞小GTP结合蛋白 NtRab5b 豆蔻酰化转录调控细胞质膜
分类号: Q943
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

烟草(Nicotiana tobacum)NtRab5b是一个植物特异性的小GTP结合蛋白,定位于内吞途径,参与烟草幼苗对盐胁迫的反应。本研究发现,NtRab5b蛋白氨基端预测为豆蔻酰化修饰位点的第2位Gly介导其与膜的结合,该位点的突变(Gly突变为Ala)导致NtRab5b(G2A)-GFP失去膜定位功能,非特异的弥散分布于细胞质和核内。结果表明,转基因细胞中NtRab5b(G2A)在mRNA水平上比NtRab5b表达上调,不同启动子控制下都有这一表达差异的存在,并且与GFP融合表达也不会引起这一表达差异的改变,说明转基因细胞中NtRab5b(G2A)和NtRab5b mRNA表达差异与外源启动子的控制及与GFP的融合表达无关,而主要在于NtRab5b(G2A)蛋白第2位甘氨酸的突变。进一步研究表明,NtRab5b第3位棕榈酰化修饰位点Cys突变的NtRab5b(C3S)-GFP定位于细胞核周围的内质网区域,并且其转录水平也比NtRab5b-GFP高,但第2位Gly的突变不会引起该突变体mRNA表达的进一步上调。而NtRab5b GTPase活性缺失突变体NtRab5b(Q92L)-GFP也丧失了内吞途径正确定位功能,主要定位在一些点状和环状结构、细胞核周围及液泡膜上而没有定位在质膜上,同时无论NtRab5b(Q92L)-GFP和NtRab5b(G2A/Q92L)-GFP,或NtRab5b(Q92L)和NtRab5b(G2A/Q92L),在转基因细胞中第二位Gly的突变都不会引起它们的mRNA水平表达差异,但比转基因细胞中NtRab5b-GFP和NtRab5b的表达都有上调。结果说明3个NtRab5b突变体NtRab5b(G2A, C3S or Q92L)都不能结合到质膜上从而不能正常参与到内吞循环,因而导致它们的mRNA表达水平比野生型的NtRab5b表达上调。因此NtRab5b可能通过与质膜的结合来调控其基因的表达。然后对NtRab5b氨基端的表达调控作用进行了分析。结果表明,NtRab5b氨基端的40个氨基酸与GFP的融合蛋白MyrN40-GFP主要定位于质膜上,第2位Gly的突变导致其失去膜定位功能,非特异地弥散分布于细胞质和核内,而其mRNA的表达显著上调;但将NtRab5b氨基端分别缩减至20个氨基酸和11个氨基酸与GFP融合表达后,Gly2的突变不能上调这些融合基因的转录,但荧光观察分析表明蛋白水平的差异可能依然存在。因此说明豆蔻酰化修饰调控NtRab5b转录水平的表达跟其序列的20~40位氨基酸有关,缺失这一段序列后,转录调控作用消失,但是豆蔻酰化依然可能在蛋白水平上,调节NtRab5b氨基端与GFP融合蛋白的表达。最后结合单独的GFP在转基因BY-2细胞(35S:GFP)的表达和定位推测,NtRab5b-GFP和MyrN40-GFP蛋白可能是通过豆蔻酰化介导的与质膜的结合达到调控自身基因表达的效果。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-10
第一章前言  10-27
  1.1 文献综述  10-24
  1.2 研究目的  24-27
第二章材料与方法  27-42
  2.1 材料  27
  2.2 试剂和试剂盒  27-28
  2.3 试剂配制  28-31
  2.4 方法  31-42
第三章结果与分析  42-64
  3.1 NtRab5b 第2 位Gly 的突变上调转基因细胞中NtRab5b 的表达  42-47
  3.2 NtRab5b 与质膜的结合调控转基因细胞中NtRab5b 的转录  47-55
  3.3 NtRab5b 氨基端介导NtRab5b 与质膜的结合并调控其表达  55-64
第四章讨论与展望  64-69
  4.1 NtRab5b 蛋白可能通过与质膜的结合，并与其他膜蛋白互作反馈抑制自身基因的转录  64-67
  4.2 豆蔻酰化修饰也在蛋白水平调控NtRab5b 的表达  67-68
  4.3 展望  68-69
参考文献  69-72
附录  72-84
  1. 论文中常见专业名词的中英文对照及缩写  72-74
  2. 各种氨基酸的缩写及中英文名称  74-75
  3.NtRab5b 核苷酸及氨基酸序列  75
  4. 各种培养基及抗生素配方  75-78
  5.引物序列表  78-79
  6. 载体图谱  79-82
  7. 仪器设备  82-83
  8. 各种反应体系  83-84
致谢  84

豆蔻酰化修饰及质膜结合在烟草小GTP结合蛋白基因NtRab5b转录调控中的作用

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