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BMPRⅡ基因转录起始位点的确定及其近侧调控元件的鉴定

作　者: 周艾彬
导　师: 周天鸿
学　校: 暨南大学
专　业: 遗传学
关键词: II型骨形成蛋白受体转录起始位点 5’-RACE 转录调控元件
分类号: Q75
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

BMPR-Ⅱ基因为Ⅱ型骨形成蛋白受体(BMPR-Ⅱ)的编码基因，BMPR-Ⅱ为一跨膜Scr／Thr激酶受体，其配体分子为骨形成蛋白(BMPs)，BMPs属于TGF-β超家族成员，BMP信号通路与骨的形成与再生、哺乳动物的早期发育、肿瘤的转移与恶化等密切相关。近年来更是发现BMPR-Ⅱ基因突变或表达异常与家族原发性肺动脉高血压和多种肿瘤的发生和转移有关，然而有关BMPR-Ⅱ基因表达的调控目前所知甚少。本研究运用5′-RACE技术成功地确定了BMPR-Ⅱ基因的转录起始位点，它位于翻译起始密码子前1013nt处；利用萤光素酶报告基因表达系统对启动子区两个潜在的SP1结合位点和一个三核苷酸(GGC)的重复序列的潜在转录调控活性进行了检测，结果初步表明这3个位点均有转录正调控作用，为深入研究人BMPR-Ⅱ基因的转录调控奠定了坚实的基础。

全文目录

目录  4-6
中文摘要  6-7
英文摘要  7-8
1 前言  8-17
  1.1 骨形成蛋白受体-Ⅱ基因结构和功能的简介  8-13
    1.1.1 BMPR-Ⅱ基因结构及其作用机制  8-10
    1.1.2 BMPR-Ⅱ基因与原发式肺动脉高血压(PPH)的关系  10-11
    1.1.3 BMPR-Ⅱ基因在肿瘤细胞中的表达  11-12
    1.1.4 BNPR-Ⅱ基因与骨的形成与再生  12
    1.1.5 BMPR-Ⅱ基因与哺乳动物早期发育  12-13
  1.2 SMART RACE技术原理  13-15
  1.3 国内外研究现状和课题意义  15-17
2 技术路线  17-19
  2.1 5′RACE定位BMPR-Ⅱ基因转录起始位点  17-18
  2.2 鉴定转录起始位点附近(-556bp～+387bp)区域内的重要调控元件  18-19
3 实验仪器与材料  19-23
  3.1 材料  19-21
    3.1.1 菌种、载体和细胞系  19
    3.1.2 主要试剂  19-20
    3.1.3 其它主要试剂的配方  20-21
  3.2 主要仪器  21-23
4 实验方法  23-37
  4.1 转录起始位点的确定  23-26
    4.1.1 A549细胞的培养  23-24
    4.1.2 细胞总RNA的抽提及鉴定  24
    4.1.3 RT-PCR对人BMPR-Ⅱ基因mRNA 5′端的步移  24-25
    4.1.4 5′RACE精确定位人BMPR-Ⅱ基因的转录起始位点  25-26
    4.1.5 RT-PCR验证RACE结果  26
  4.2 -556bp～+387bp启动子片段中调控元件的鉴定  26-34
    4.2.1 重叠延伸PCR突变BMPR-Ⅱ基因-556bp～+387bp启动子区中的3个寡核苷酸片段  27-32
    4.2.2 酶切  32
    4.2.3 PCR清洁(pGL3-Basic质粒双酶切清洁)  32-33
    4.2.4 连接  33
    4.2.5 制备感受态细胞  33
    4.2.6 转化  33-34
    4.2.7 接种  34
    4.2.8 快速鉴定  34
    4.2.9 抽质粒  34
    4.2.10 重组质粒鉴定  34
  4.3 Hela细胞培养  34-35
  4.4 重组质粒转染及瞬时表达  35
  4.5 双荧光素酶试验  35-37
    4.5.1 HeLa细胞裂解物的制备  35
    4.5.2 双荧光素酶活性测定  35-37
5 实验结果  37-47
  5.1 5′RACE及其结果鉴定  37-41
    5.1.1 RT-PCR对人BMPR-Ⅱ基因mRNA 5′端的步移  37
    5.1.2 5′RACE对人BMPR-Ⅱ基因转录起始位点的精确定位  37-41
    5.1.3 RT-PCR验证RACE结果  41
  5.2 BMPR-Ⅱ基因-556bp～+387bp片段突变及克隆鉴定  41-45
    5.2.1 重叠延伸PCR对第一个SP1结合位点(960MU1)进行突变  41-42
    5.2.2 960MU1重组质粒测序鉴定  42-43
    5.2.3 重叠延伸PCR对第二个SP1结合位点(960MU2)进行突变  43-44
    5.2.4 960MU2重组质粒测序鉴定  44
    5.2.5 重叠延伸PCR对GGC三核苷酸重复序列位点(6GC12)进行突变  44-45
    5.2.6 GGC12突变重组质粒测序鉴定  45
  5.3 重组报告质粒转染Hela细胞及双萤光素酶活性测定  45-47
6 讨论  47-51
  6.1 关于人BMPR-Ⅱ基因转录起始位点的确定  47-48
  6.2 关于SP1对BMPR-Ⅱ基因的转录激活作用  48-50
  6.3 关于GGC三核苷酸重复的表达调控功能  50-51
7 结论  51-52
参考文献  52-56
附录  56-63
致谢  63

BMPRⅡ基因转录起始位点的确定及其近侧调控元件的鉴定

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