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雨生红球藻中虾青素合成相关酶基因的转录调控序列分析

作　者: 魏炜
导　师: 秦松
学　校: 中国科学院研究生院（海洋研究所）
专　业: 海洋生物学
关键词: 雨生红球藻虾青素转录调控启动子顺式作用元件
分类号: Q946
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

虾青素是一种具有极强抗氧化活性的类胡萝卜素,具有广泛的应用价值。雨生红球藻是一种单细胞绿藻,在逆境胁迫条件下能够大量合成并迅速积累虾青素,其积累量最高可达细胞干重的4%,从而成为目前首选的天然虾青素合成工具。但是,虾青素的大量积累总是发生在不适于生物量积累的环境胁迫条件下,虾青素积累与生物量积累之间成为一对矛盾,制约着虾青素大量生产。异戊烯焦磷酸异构酶(IPI)、β-胡萝卜素酮化酶(BKT)和β-胡萝卜素氧化酶(CRTO)是虾青素合成过程中的相关酶。已有研究结果表明,这些酶基因的表达调控至少是部分发生在转录水平上的,这就为我们从转录水平上研究虾青素生物合成关键酶基因的调控机制提供了重要线索。本文研究结果如下:1.利用基因组步移的方法克隆了两条异戊烯焦磷酸异构酶基因(ipi)的5’上游侧翼序列(1.8kb和2.5kb),预示着ipi的转录由不止一个启动子调控。2.利用上述方法克隆了两条β-胡萝卜素氧化酶基因(crtO)5’上游侧翼序列(1kb和2kb)。以lacZ为报告基因的瞬间表达实验结果表明,长度为320bp(-682/-363)的crtO 5’上游侧翼序列具有很强的启动转录活性,提示这段序列包含了启动子的结构。3.利用凝胶阻滞的方法研究了雨生红球藻中bkt强启动转录活性区域,即309bp(-617/-309)启动子区域的转录因子结合位点,并发现在-396/-338的59bp区域内存在特异的核蛋白结合位点。通过序列分析,发现此59bp区域并不包含TATA或者CAAT-box,而是存在对光、缺氧、p-香豆酸及激素反应的G-box。4.根据国外已经获得的ipi和crtO全长cDNA序列,利用长距离PCR法从红球藻基因组中扩增到基因组序列。发现ipi和crtO均包含6个外显子和5个内含子,内含子的剪切位点基本符合GU-AG规律。并通过似然比检验(Likelihoodratio test)的方法发现两基因在进化过程中存在着正选择现象。这些工作为下一步继续寻找与上述特定DNA调控区域特异结合的反式作用因子(蛋白质因子)奠定了基础。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-7
第一章引言  7-25
  1 研究真核生物基因转录调控的方法  8-12
    1.1 启动子的检测  9-10
    1.2 DNA 结合蛋白的检测  10-11
    1.3 基因转录活性的检测  11-12
  2 真核生物基因转录调控研究进展  12-16
    2.1 脱落酸应答基因的转录调控  13
    2.2 光应答基因的调控  13-15
    2.3 叶特异性启动子  15-16
  3 藻类基因表达调控研究进展  16-19
    3.1 藻类相关基因的启动子研究  16-17
    3.2 藻类相关基因的反式作用因子研究  17-18
    3.3 外界环境条件对藻类相关基因转录的影响  18
    3.4 展望  18-19
  4 雨生红球藻中虾青素合成酶系基因的调控研究  19-25
    4.1 雨生红球藻中虾青素的生物合成途径  19-22
    4.2 雨生红球藻中虾青素合成酶系基因的调控研究  22-25
第二章异戊烯焦磷酸异构酶基因和β-胡萝卜素氧化酶基因序列的克隆与分析  25-44
  1 材料与方法  25-30
    1.1 雨生红球藻的材料培养  25
    1.2 菌株、克隆载体、工具酶  25
    1.3 红球藻总DNA 提取  25-26
    1.4 引物设计及合成  26
    1.5 PCR 扩增获得ipi 和crtO 的染色体DNA 片段  26-27
    1.6 T-A 克隆及测序  27-29
    1.7 序列分析  29
    1.8 系统发育分析  29-30
  2 结果与分析  30-41
    2.1 红球藻DNA 的提取  30
    2.2 ipi 和crtO 基因组DNA 片段的扩增  30-31
    2.3 序列分析  31-41
  3 讨论  41-44
第三章异戊烯焦磷酸异构酶基因和β-胡萝卜素氧化酶基因5'上游侧翼序列的克隆和序列分析  44-71
  1 材料与方法  44-52
    1.1 雨生红球藻的材料培养  44
    1.2 主要试剂(菌株、克隆载体、工具酶)  44
    1.3 Universal GenomeWalker 工作原理  44-46
    1.4 基因组DNA 的提取  46
    1.5 引物设计及合成  46-47
    1.6 GenomeWalker ‘Libraries’的构建  47-49
    1.7 PCR 扩增  49-52
  2 结果与分析  52-68
    2.1 GenomeWalker ‘Libraries’的构建  52-53
    2.2 ipi 基因5'上游侧翼序列的步移  53-57
    2.3 crtO 基因5'上游侧翼序列的步移  57-61
    2.4 关于ipi 和crtO 基因转录调控方式多样性的初步证明  61-68
  3 讨论  68-71
第四章 β-胡萝卜素酮化酶启动子功能分析及β-胡萝卜素氧化酶基因5'上游侧翼序列的功能验证  71-87
  1 凝胶阻滞法分析bkt 启动子序列  71-80
    1.1 材料与方法  71-77
    1.2 结果与分析  77-80
    1.3 讨论  80
  2 基因枪转化和组织化学染色  80-87
    2.1 材料与方法  80-84
    2.2 结果与分析  84-85
    2.3 讨论  85-87
结论  87-89
参考文献  89-99
致谢  99-100
发表及已完成文章目录  100

雨生红球藻中虾青素合成相关酶基因的转录调控序列分析

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