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小干扰RNA对小鼠Znf313基因的沉默作用及人ZNF313基因的转录调控研究

作　者: 洪志霞
导　师: 鲍锦库；马用信
学　校: 四川大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: RNAi Znf313基因 shRNA 重组表达载体 ZNF313基因 转录调控 启动子 荧光素酶报告基因 生物信息学 H293T细胞 pEGFP-N1
分类号: Q75
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


哺乳类动物的精子发生（spermatogenesis）是一个十分复杂的细胞分化过程，要经历有丝分裂、减数分裂和精子形成三个阶段。这一过程受多种因素的调控，而生精细胞内基因水平的调节，在精子发生过程中起着决定性的作用。近年来随着基因克隆、表达及功能研究技术的发展和应用，发现了许多精子发生的相关基因，研究这些基因将对更深入地了解精子发生的分子机理和阐明男性原发不育的遗传病因具有重要的理论和临床意义。 四川大学华西医院医学遗传研究室采用消减杂交、mRNA差异显示、RACE等方法先后克隆了多个与生精过程相关的基因，如：人TCP11、ZNF230、ZNF313、ZNF463以及小鼠Znf30、Znf313等基因。其中多个为编码锌指蛋白的基因。人ZNF313基因定位于20q13，编码的228个氨基酸的锌指蛋白，同时含有C2H2和C3HC4锌指结构域。由于不同的加尾信号产生两个不同长度的转录本，其中750 bp的转录本在睾丸组织中高表达，同时也在多种组织中有表达。提示该基因有可能参与了睾丸组织的发育过程，调控了精子的发生。 本文选择了小鼠Znf313基因为研究对象，用pSUPERneo干扰表达载体构建了针对小鼠Znf313基因的两个shRNA重组表达载体。瞬时转染小鼠正常胚胎成纤维细胞—NIH3T3细胞，RT-PCR和Western-blotting检测结果显示，NIH3T3细胞中均出现了Znf313基因mRNA和蛋白水平的明显下降，转然后48小时的相对抑制率为80％左右。 本研究表明重组shRNA表达载体可诱导培养细胞的RNAi现象，对小鼠

全文目录


第一部分  5-23
  中文摘要  5-7
  英文摘要  7-9
  1 引言  9-11
  2 材料与方法  11
    2.1 材料和试剂  11
    2.2 仪器  11
  3 实验方法  11-16
    3.1 重组质粒pSUPER-shRNA的构建和鉴定  11-14
      3.1.1 靶点的选择与设计  11-12
      3.1.2 寡核苷酸退火  12-13
      3.1.3 载体的线性化  13
      3.1.4 连接寡核苷酸与载体  13
      3.1.5 转化感受态细胞  13-14
      3.1.6 质粒提取和阳性克隆的鉴定  14
      3.1.7 阳性克隆的再扩增  14
    3.2 细胞培养及转染  14-15
    3.3 细胞总RNA的抽提及定量  15
    3.4 RT-PCR检测小鼠ZNF313mRNA的表达  15
    3.5 Wetern blot杂交  15-16
  4 结果  16-20
    4.1 重组质粒pSUPER-shRNA的构建和鉴定  16-17
    4.2 细胞培养及转染  17-18
    4.3 ZNF313mRNA的RT-PCR检测  18-19
    4.4 Western blot检测  19-20
  5 讨论  20-21
  参考文献  21-23
第二部分 人ZNF313基因的启动子克隆分析及其荧光蛋白融合表达载体在细胞中的定位  23-39
  摘要  23-24
  Abstract  24-26
  1引言  26-27
  2材料与方法  27-30
    2.1材料和试剂  27
    2.2主要仪器  27
    2.3方法  27-30
      2.3.1设计合成扩增人ZNF313基因启动子的PCR引物  27-28
      2.3.2重组荧光素酶报告基因表达载体的构建  28
      2.3.3.重组荧光融合蛋白基因表达载体的构建  28-29
      2.3.4细胞培养  29
      2.3.5重组荧光素酶报告基因表达载体转染H293T细晌系  29
      2.3.6重组真核表达载体pEGFP-ZNF313转染H293T细胞系  29
      2.3.7荧光素酶相对活性测定  29
      2.3.8荧光显微镜观察ZNF313在H293T细胞中的表达情况  29-30
  3结果  30-34
    3.1人ZNF基因启动子的软件分析和引物设计  30
    3.2人ZNF基因启动子区四个不同片段的PCR扩增结果  30-31
    3.3人ZNF313甚因启动子四种荧光素酶表达载体的构建  31
    3.4人ZNF基因启动子的荧光素酶相对活性分析  31-32
    3.5 重组真核表达质粒pEGFP-ZNF313的构建  32
    3.6人ZNF313在H393T细胞中的表达情况及定位  32-34
  4讨论  34-36
  参考文献  36-39
综述 RNA干涉和疾病治疗  39-47
  引言  39
  1 RNAi用于抗HBV、HCV治疗  39-40
  2 RNAi与抗HIV感染  40-41
  3 RNAi与神经系统疾病  41-43
    3.1 阿尔茨海默病  42
    3.2 poly(Q)疾病  42-43
    3.3 遗传性痉挛截瘫  43
  4 RNAi与其它疾病  43
  5 前景与展望  43-45
  参考文献  45-47
附录  47-49
发表论文  49-51
致谢  51-52

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 分子遗传学
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