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马传染性贫血病毒分离株WH17全基因组克隆、序列分析及LTR启动子活性研究

作　者: 鲁山
导　师: 童光志；陈焕春
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 马传染性贫血病毒 前病毒 序列分析 长末端重复序列 转录调控
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)是反转录病毒科慢病毒属成员之一，可以引起马属动物的一种急性烈性传染病，以贫血、持续感染、反复发热为特征，终生持续感染，是马属动物最重要的传染病之一。反转录病毒前病毒基因组长末端重复序列(LTR)对病毒复制有重要的调控作用，影响到病毒的复制动力学、细胞嗜性、致病力等方面。 本研究利用PCR方法分四个片段扩增了从自然感染马分离的马传染性贫血病毒(简称马传贫)的前病毒DNA，将PCR产物克隆于pMD18-T载体，得到四个重组质粒P2.8、P2.4、P2.6、P1.2。经PCR、酶切鉴定后进行序列测定，分析、拼接得到马传染性贫血病毒野外分离株前病毒的全基因组序列，其基因组全长8268bp。通过DNAStar分析，此分离株与马传贫病毒L株(L-EIAV)、马传贫驴强毒株(DA-EIAV)、马传贫驴白细胞弱毒疫苗株(DLA-EIAV)的序列同源性分别为86.0％、85.8％和85.2％。 通过对EIAV分离株WH17的LTR与L株、DA和DLA株的LTR序列进行比较，发现其在在U3-R结合处多一个E-box基序，推测该基序的变化可能会起到促进转录作用，为此将EIAV强毒株(DLA-25)、驴白细胞弱毒株(DLA-118)、EIAV分离株WH17以及U3-R结合处的E-box基序点突变的LTR分别克隆到pCAT3-basic质粒中的报告基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)的上游，获得一系列受不同LTR控制的CAT表达质粒。分别将含有不同来源LTR的CAT表达质粒转染驴胎皮肤细胞(FDD)、驴白细胞及接种EIAV弱毒的FDD及驴白细胞，结果显示：在驴白细胞Tat蛋白可以特异性地增强EIAV-DLALTR的启动子活性，分离株WH17LTR的U3-R结合处的E-box基序对Tat的反式激活作用并无明显影响，而在驴胎皮肤细胞中，LTR启动活性也没有检测到。结果提示：EIAV分离株WH17的LTR U3-R结合处的E-box基序没有起到促进转录的作用，LTR是病毒嗜性影响的因素之一。

全文目录


目录  3-5
摘要  5-6
Abstract  6-7
文献综述  7-25
  1.1 马传染性贫血病毒概述  7-12
    1.1.1 EIAV的历史及分类地位  7-8
    1.1.2 EIAV的形态和理化特性  8-9
    1.1.3 国内外EIAV毒株及特性  9-10
    1.1.4 EIAV的血凝性  10-11
    1.1.5 EIAV的细胞嗜性  11
    1.1.5 EIAV的致病性  11-12
  1.2 马传染性贫血病毒的分子生物学  12-21
    1.2.1 EIAV基因组结构  13-14
    1.2.2 gag基因及其编码蛋白  14-15
    1.2.3 pol基因及其编码蛋白  15-16
    1.2.4 env基因及其编码产物  16-18
    1.2.5 EIAV的其它小开放阅读框架及其编码产物  18-19
    1.2.6 EIAV的非编码区-LTR  19-21
  1.3 慢病毒与糖基化  21
  1.4 EIAV的复制、蛋白质合成和形态发生  21-23
  1.5 EIAV分子致病机制  23-24
  1.6 EIAV感染的免疫控制  24-25
第二章 马传染性贫血病毒分离株的全基因组克隆和序列分析  25-42
  2.1 研究目的和意义  25
  2.2 材料和方法  25-28
    2.2.1 毒株  25
    2.2.2 实验动物  25
    2.2.3 酶和主要试剂  25-26
    2.2.4 引物设计  26
    2.2.5 大肠杆菌感受态细胞制备(氯化钙法)  26-27
    2.2.6 质粒的转化  27
    2.2.7 质粒的少量制备(碱裂解法)  27
    2.2.8 前病毒全基因的PCR扩增  27
    2.2.9 基因的克隆与鉴定  27
    2.2.10 序列测定和分析  27-28
  2.3 结果  28-42
    2.3.1 PCR扩增和重组质粒的鉴定  28
    2.3.2 前病毒全基因组序列  28-35
    2.3.3 分离株WH17与国内L株、DA、DLA株核苷酸和氨基酸比较  35-36
    2.3.4 分离株WH17与国外毒株核苷酸和氨基酸序列比较  36-37
    2.3.5 gag、pol和其编码的蛋白的比较结果  37
    2.3.6 gp90序列分析  37-39
    2.3.7 LTR序列分析  39-40
    2.3.8 TAT的比较结果  40
    2.3.9 S2蛋白的比较  40-41
    2.3.10 REV蛋白的比较  41-42
第三章 马传染性贫血病毒分离株WH17LTR(长末端重复序列)启动子活性研究  42-51
  3.1 研究目的与意义  42
  3.2 材料和方法  42-46
    3.2.1 载体和细胞  42
    3.2.2 毒株  42
    3.2.3 试剂和引物  42-43
    3.2.4 PCR的扩增  43
    3.2.5 E-box的点突变(N-191C-T)  43-44
    3.2.6 重组质粒pLTR的构建  44
    3.2.7 质粒的纯化  44-45
    3.2.8 重组EIAV Tat瞬时表达与间接免疫荧光检测  45
    3.2.9 PCDNA3.1-Tat转染FDD和健康驴白细胞  45
    3.2.10 间接免疫荧光检测Tat的表达  45-46
    3.2.11 重组质粒pLTR转染EIAV阴性健康驴白细胞和FDD细胞  46
    3.2.12 CAT活性的检测  46
  3.3 结果  46-49
    3.3.1 重组质粒的鉴定  47
    3.3.2 重组质粒的酶切鉴定  47
    3.3.2 突变分子克隆的获得  47
    3.3.3 PCDNA3.1-Tat的间接免疫荧光检测  47-48
    3.3.4 CAT ELISA检测结果  48-49
  3.2 讨论  49-51
讨论  51-54
结论  54-55
参考文献  55-62
致谢  62-63
附录  63

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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