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鸡堆型艾美尔球虫免疫增强型核酸疫苗构建及其免疫效应

作　者: 张恒
导　师: 李广兴
学　校: 东北农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 鸡球虫 Ea1A基因鸡白细胞介素18 融合基因免疫
分类号: S858.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 85次
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内容摘要

鸡球虫病(Coccidiosis)是由一种以肠道病变为主的寄生虫病,给养鸡业造成了巨大经济损失。目前鸡球虫病主要以药物防治为主,但由于药物残留和耐药性问题,使得一些药物难以发挥其有效的疗效。球虫疫苗的研究,特别是新型球虫核酸疫苗研究,逐渐成为球虫病防治研究的新焦点。本试验根据已发表的堆型艾美尔球虫(E. acervulina) Ea1A基因序列设计引物,成功克隆上海株堆型艾美尔球虫的部分Ea1A基因,大小为1256 bp。同时构建Ea1A和ChIL-18的原核表达质粒,表达大小分别为51 KDa和26 KDa的Ea1A和ChIL-18蛋白,利用镍离子亲和树脂纯化后免疫新西兰白兔,制备兔抗Ea1A和ChIL-18多克隆抗体。经间接免疫荧光试验和Western blot证明制备的多克隆抗体均具有良好的反应性。本研究利用一段编码(G4S)3多肽的碱基linker序列将3-1E与Ea1A基因进行连接,成功构建了一个融合基因真核表达载体质粒,即PVAX-3-1E-linker-Ea1A质粒。融合基因质粒体外瞬时转染和体内接种试验表明表达的融合蛋白可以被Ea1A多克隆抗体和3-1E多克隆抗体检测出来,进一步证明了融合基因表达的蛋白具有两段基因各自的生物活性,为后续动物免疫试验提供了理论基础。动物免疫试验分为7个组,即PBS组(PBS对照组)、PVAX组(PVAX空质粒免疫组)、IL-18组(PVAX-IL-18真核质粒免疫组)、3-1E组(PVAX-3-1E真核质粒免疫组)、Ea1A组(PVAX-Ea1A真核质粒免疫组)、LK组(PVAX-3-1E-linker-Ea1A融合基因真核质粒免疫组),以及LK+组(PVAX-3-1E-linker-Ea1A融合基因真核质粒和PVAX-IL-18真核质粒免疫组)。利用淋巴细胞增殖试验、酶联免疫吸附试验、免疫器官指数对不同处理组雏鸡的各项免疫指标进行检测,评价真核表达质粒的免疫效应。结果表明,5组疫苗免疫组各日龄雏鸡的免疫指标均高于组对照组,其中有ChIL-18、LK、LK+三组免疫组免疫应答反应尤为突出。其中T、B淋巴细胞增殖功能、外周血液中抗3-1E和Ea1A特异性抗体水平以及免疫器官指数与对照组相比较都有明显的提高,而且以LK+组最为显著。综上所述,3-1E与Ea1A融合基因真核表达质粒不但能刺激机体的细胞免疫应答,而且能够刺激机体体液免疫应答,ChIL-18基因可以提高3-1E与Ea1A融合基因真核表达质粒刺激机体产生细胞免疫应答和体液免疫应答能力,进而提高机体抵抗球虫攻击的能力。本试验研究为进一步研究ChIL-18的生物学活性提供了试验依据,同时为探讨开发研制新型免疫增强型抗球虫核酸疫苗提供了理论基础。

全文目录

中文摘要  10-11
英文摘要  11-13
1 前言  13-29
  1.1 鸡堆型艾美尔球虫研究进展  13-18
    1.1.1 堆型艾美尔球虫研究概况  13
    1.1.2 堆型艾美尔球虫生物特性  13-14
    1.1.3 堆型艾美尔球虫生活史及致病性  14
    1.1.4 堆型艾美尔球虫疫苗  14-16
    1.1.5 球虫体外培养  16-17
    1.1.6 球虫耐药性及防治  17-18
    1.1.7 小结  18
  1.2 鸡球虫主要抗原基因研究进展  18-24
    1.2.1 卵囊表面抗原  18
    1.2.2 子孢子表面抗原  18-20
    1.2.3 裂殖生殖阶段抗原  20
    1.2.4 配子生殖阶段抗原  20-21
    1.2.5 微线蛋白  21-22
    1.2.6 折光体蛋白  22-23
    1.2.7 其他抗原基因  23-24
    1.2.8 小结  24
  1.3 白细胞介素18 及鸡白细胞介素18 研究进展  24-28
    1.3.1 白细胞介素18 研究进展  24-26
    1.3.2 鸡IL-18 及其生物学活性  26-27
    1.3.3 ChIL-18 在球虫病防治中的应用  27-28
  1.4 目的和意义  28-29
2 材料与方法  29-53
  2.1 试验材料  29-30
    2.1.1 虫株、试验动物  29
    2.1.2 菌株、载体及质粒  29
    2.1.3 主要工具酶、抗体及分子生物学试剂  29
    2.1.4 主要生化试剂  29-30
    2.1.5 主要试验仪器设备  30
  2.2 试验方法  30-52
    2.2.1 堆型艾美尔球虫Ea1A 基因克隆及序列分析  30-36
    2.2.2 堆型艾美尔球虫Ea1A 基因和鸡IL-18 基因的原核蛋白表达及纯化  36-39
    2.2.3 鸡IL-18 原核表达蛋白复性及生物活性检测  39-40
    2.2.4 Ea1A 和ChIL-18 多克隆抗体制备和生物活性检测  40-41
    2.2.5 重组真核表达质粒的构建  41-43
    2.2.6 PVAX-3-1E-linker-Ea1A 真核表达质粒的构建  43-46
    2.2.7 重组质粒体外和体内表达的检测  46-49
    2.2.8 重组真核表达质粒在雏鸡体内免疫效果检测  49-52
  2.3 数据处理  52-53
3 试验结果  53-81
  3.1 鸡堆型艾美尔球虫Ea1A 基因克隆及序列分析  53-56
    3.1.1 孢子化卵囊总RNA 的提取  53
    3.1.2 堆型艾美尔球虫Ea1A 基因的扩增  53-54
    3.1.3 重组质粒pMD18-T-Ea1A 鉴定  54
    3.1.4 重组质粒pMD18-T-Ea1A 序列测定及二级结构预测分析  54-56
  3.2 鸡堆型艾美尔球虫Ea1A 基因和鸡IL-18 基因的原核蛋白表达和纯化  56-61
    3.2.1 重组表达质粒pET30a-Ea1A 的鉴定  56
    3.2.2 重组表达质粒pET30a-IL-18 的鉴定  56-57
    3.2.3 堆型艾美尔球虫Ea1A 原核蛋白表达及纯化  57-60
    3.2.4 ChIL-18 原核蛋白表达及纯化  60-61
  3.3 ChIL-18 原核表达蛋白复性及生物活性检测  61-62
  3.4 Ea1A 和ChIL-18 的多克隆抗体生物活性  62-63
    3.4.1 Ea1A 的多克隆抗体抗体效价  62
    3.4.2 ChIL-18 的多克隆抗体抗体效价  62
    3.4.3 Ea1A 多克隆抗体生物活性  62
    3.4.4 ChIL-18 的多克隆抗体生物活性  62-63
  3.5 重组真核表达质粒的构建和鉴定  63-65
    3.5.1 重组质粒PVAX-3-1E 质粒PCR 和酶切鉴定  63-64
    3.5.2 重组质粒PVAX-IL-18 质粒PCR 和酶切鉴定  64
    3.5.3 重组质粒PVAX-Ea1A 质粒PCR 和酶切鉴定  64-65
  3.6 PVAX-3-1E-linker-Ea1A 真核表达质粒的构建和鉴定  65-68
    3.6.1 重组质粒PVAX-3-1E-1 的PCR 鉴定和酶切鉴定  65
    3.6.2 重组质粒PVAX-3-1E-linker-Ea1A 的PCR 鉴定和酶切鉴定  65-67
    3.6.3 PVAX-3-1E-linker-Ea1A 融合基因真核表达质粒二级结构的预测分析  67-68
  3.7 重组质粒体外和体内表达  68-74
    3.7.1 重组质粒PVAX-3-1E 体外瞬时表达  68
    3.7.2 重组质粒PVAX-IL-18 外瞬时表达  68-70
    3.7.3 重组质粒体PVAX-Ea1A 外瞬时表达  70
    3.7.4 重组质粒体PVAX-3-1E-linker-Ea1A 外瞬时表达  70-72
    3.7.5 RT-PCR 检测真核质粒在鸡体内表达  72
    3.7.6 间接免疫荧光检测肌肉组织中抗原基因蛋白表达  72
    3.7.7 Western-blot 检测肌肉组织中抗原基因表达  72-74
  3.8 重组质粒免疫雏鸡后机体免疫效应  74-81
    3.8.1 雏鸡胸腺T 淋巴细胞增殖功能动态变化  74
    3.8.2 雏鸡外周血液T 淋巴细胞增殖功能动态变化  74-75
    3.8.3 雏鸡脾脏T 淋巴细胞增殖功能动态变化  75-76
    3.8.4 雏鸡血液B 淋巴细胞增殖功能动态变化  76
    3.8.5 雏鸡脾脏B 淋巴细胞增殖功能动态变化  76-77
    3.8.6 雏鸡免疫器官指数动态变化  77-79
    3.8.7 雏鸡体内抗体动态变化  79
    3.8.8 雏鸡增重动态变化  79-81
4 讨论  81-91
  4.1 Ea1A 基因的克隆鉴定和表达及其多克隆抗体制备  81-82
    4.1.1 Ea1A 抗原基因的选择以及基因的克隆  81
    4.1.2 Ea1A 蛋白表达纯化  81-82
    4.1.3 Ea1A 多克隆抗体制备及其生物活性检测  82
  4.2 ChIL-18 蛋白的表达和多克隆抗体制备及其生物学活性  82-84
    4.2.1 ChIL-18 蛋白的表达及复性  82-83
    4.2.2 CHIL18 多克隆抗体生物活性检测  83
    4.2.3 ChIL-18 的生物活性检测  83-84
  4.3 PVXA1-3-1E-linker-Ea1A 融合基因真核表达质粒构建及体内外表达  84-87
    4.3.1 PVXA1-3-1E-linker-Ea1A 融合基因真核表达质粒构建  84-86
    4.3.2 PVXA1-3-1E-linker-Ea1A 融合基因真核载体表达质粒体外瞬时转染鉴定结果及分析  86
    4.3.3 真核表达质粒鸡体内注射免疫检测抗原基因表达分析  86-87
  4.4 重组质粒免疫雏鸡后机体的免疫效应  87-91
    4.4.1 雏鸡免疫后T 淋巴细胞增殖功能变化结果分析  88
    4.4.2 雏鸡免疫后B 淋巴细胞增殖功能变化结果分析  88-89
    4.4.3 雏鸡免疫器官指数分析  89
    4.4.4 雏鸡外周血液抗体含量动态变化结果分析  89-91
5 结论  91-92
致谢  92-93
参考文献  93-101
攻读硕士学位期间发表的学术论文  101

鸡堆型艾美尔球虫免疫增强型核酸疫苗构建及其免疫效应

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