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银杏抗氧化肽的制备、结构鉴定及活性研究

作　者: 贾韶千
导　师: 吴彩娥
学　校: 南京林业大学
专　业: 森林培育
关键词: 银杏 抗氧化肽 分离纯化 结构鉴定 固相合成
分类号: S792.95
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


本论文以银杏种仁为原料,研究了银杏抗氧化肽的制备工艺,并对其进行了结构鉴定,检验了其抗氧化活性,为银杏种仁的综合利用提供了依据。主要研究结果如下：(1)通过均匀设计对碱法制备银杏种仁蛋白的工艺进行了优化,得到的最佳提取条件为：提取时间12h、料液比1：26、NaOH溶液质量分数0.2%,在此条件下提取率达到了89.14%。(2)采用2709碱性蛋白酶和胃蛋白酶为双酶法的酶源,对银杏种仁蛋白进行酶解,以还原能力为指标考察酶解效果。通过单因素试验和响应面分析优化得到双酶法酶解银杏种仁蛋白制备抗氧化肽的最佳工艺条件,首先添加2709碱性蛋白酶,酶解条件为：底物浓度2%、酶用量为6976U.g1、酶解温度为55℃、pH值为8.9、酶解时间为5h；然后添加胃蛋白酶,酶解条件为：酶用量为9000U.g-1、pH值为3.0、酶解温度为50℃、酶解时间为2h。在此条件下得到的银杏种仁蛋白酶解液的还原能力A700为1.636。(3)通过考察持水性、吸油性、溶解性、起泡性及泡沫稳定性、乳化性及乳化稳定性等指标,对银杏种仁蛋白及其酶解产物的功能特性进行研究。结果发现,银杏种仁蛋白酶解后,其酶解产物的功能特性得到了提高,溶解性、起泡性和乳化性得到了显著的改善。(4)采用不同的体外抗氧化指标对不同浓度的银杏种仁蛋白酶解产物的抗氧化活性进行了测定。随着银杏种仁蛋白酶解产物浓度的增加,其抗氧化活性呈现不断上升的趋势,表现出一定的量效关系。双酶分步水解可以提高银杏种仁蛋白酶解产物的抗氧化活性。(5)采用葡聚糖凝胶Sephadex G-25、Sephadex G-10和半制备RP-HPLC对银杏种仁蛋白酶解产物进行分离纯化,通过对自由基清除能力的测定,得到了抗氧化活性较强的组分C8和C9。(6)采用MALDI-SYNAPT-Q-TOF-MS质谱分析法测定组分C8和C9的相对分子量分别为452.21和988.49。结合TOF-MS/MS串联质谱和氨基酸组成分析得知C8的氨基酸序列为：YVGD(Tyr-Val-Gly-Asp); C9的氨基酸序列为：LGNTDYAVH (Leu-Gly-Asn-Thr-Asp-Tyr-Ala-Val-His)。(7)采用固相合成法中的快速Fmoc法合成了抗氧化活性肽YVGD和LGNTDYAVH,并采用不同的体外抗氧化试验对其抗氧化活性进行验证。结果表明银杏抗氧化肽YVGD和LGNTDYAVH具有较高的抗氧化活性,且抗氧化活性随浓度的升高而增强,呈现出较强的量效关系。

全文目录


致谢  3-4
摘要  4-5
Abstract  5-11
第一章 绪论  11-35
  1.1 银杏蛋白  11-14
    1.1.1 银杏发展概况  11-12
    1.1.2 银杏蛋白研究进展  12-14
  1.2 生物活性肽的研究进展  14-19
    1.2.1 抗氧化肽  14-15
    1.2.2 抗菌肽  15-16
    1.2.3 免疫调节肽  16
    1.2.4 阿片肽及阿片拮抗肽  16-17
    1.2.5 抗肿瘤肽  17
    1.2.6 抗血栓肽  17-18
    1.2.7 抗艾滋病肽  18
    1.2.8 降血压肽  18-19
  1.3 氧化伤害及抗氧化  19-21
    1.3.1 自由基的产生机理及来源  19-20
    1.3.2 自由基的伤害及防御  20-21
  1.4 抗氧化肽的研究进展  21-26
    1.4.1 抗氧化肽的制备  21-22
    1.4.2 抗氧化肽的分离纯化  22-24
    1.4.3 抗氧化肽的活性检验  24-25
    1.4.4 抗氧化肽的结构鉴定  25-26
  1.5 本研究的目的与意义  26-27
  1.6 本研究的主要内容  27-28
  参考文献  28-35
第二章 均匀设计优化碱法制备银杏种仁蛋白  35-45
  2.1 材料与方法  35-40
    2.1.1 试验材料与试剂  35-36
    2.1.2 试验仪器  36
    2.1.3 试验方法  36-40
    2.1.4 数据分析  40
  2.2 结果与分析  40-42
    2.2.1 银杏种仁中不同蛋白的含量  40
    2.2.2 均匀设计提取工艺的结果与回归分析  40-41
    2.2.3 最佳提取条件的验证  41
    2.2.4 蛋白质活性验证  41-42
  2.3 讨论  42-43
  2.4 本章小结  43-44
  参考文献  44-45
第三章 双酶分步水解银杏种仁蛋白制备抗氧化肽  45-63
  3.1 材料与方法  46-49
    3.1.1 试验材料与试剂  46
    3.1.2 试验仪器  46
    3.1.3 试验方法  46-47
    3.1.4 试验设计  47-48
    3.1.5 测定指标  48-49
    3.1.6 数据分析  49
  3.2 结果与分析  49-61
    3.2.1 蛋白酶的筛选  49-50
    3.2.2 蛋白酶的添加顺序  50
    3.2.3 2709碱性蛋白酶单因素试验  50-53
    3.2.4 响应面试验结果与分析  53-57
    3.2.5 胃蛋白酶单因素试验结果  57-59
    3.2.6 胃蛋白酶正交试验及方差分析  59-61
  3.3 讨论  61
  3.4 本章小结  61-62
  参考文献  62-63
第四章 银杏种仁蛋白酶解产物的功能特性研究  63-77
  4.1 材料与方法  64-65
    4.1.1 试验材料与试剂  64
    4.1.2 试验仪器  64
    4.1.3 试验方法  64-65
  4.2 结果与分析  65-74
    4.2.1 持水性和吸油性  65-66
    4.2.2 溶解性  66
    4.2.3 起泡性及泡沫稳定性  66-70
    4.2.4 乳化性及乳化稳定性  70-74
  4.3 讨论  74
  4.4 本章小结  74-75
  参考文献  75-77
第五章 银杏种仁蛋白酶解产物的抗氧化活性研究  77-93
  5.1 材料与方法  78-81
    5.1.1 试验材料与试剂  78
    5.1.2 试验仪器  78
    5.1.3 试验方法  78-81
  5.2 结果与分析  81-88
    5.2.1 二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)清除能力的测定  81
    5.2.2 羟自由基(·OH)清除能力的测定  81-82
    5.2.3 超氧阴离子自由基(O_2~-·)清除能力的测定  82-83
    5.2.4 过氧化氢清除能力的测定  83-84
    5.2.5 亚油酸体系中抗氧化能力的检测—硫氰酸铁法  84
    5.2.6 螯合金属离子能力的测定  84-85
    5.2.7 还原能力的测定  85-86
    5.2.8 抑制H_2O_2诱导的小鼠红细胞溶血实验  86
    5.2.9 抑制肝脂质过氧化试验  86-87
    5.2.10 银杏种仁蛋白酶解产物抗氧化活性和水解度的关系  87-88
  5.3 讨论  88-89
  5.4 本章小结  89-91
  参考文献  91-93
第六章 银杏抗氧化肽的分离纯化及结构鉴定  93-109
  6.1 材料与方法  93-96
    6.1.1 试验材料与试剂  93-94
    6.1.2 试验仪器  94
    6.1.3 试验方法  94-96
  6.2 结果与分析  96-105
    6.2.1 Sephadex G-25分离纯化结果  96-98
    6.2.2 Sephadex G-10分离纯化结果  98-99
    6.2.3 半制备型液相色谱分离纯化结果  99-100
    6.2.4 HPLC液相色谱分析  100-101
    6.2.5 氨基酸组成分析  101-102
    6.2.6 组分C8的分子量及结构鉴定  102-103
    6.2.7 组分C9的分子量及结构鉴定  103-104
    6.2.8 抗氧化活性肽的序列比对  104-105
  6.3 讨论  105-106
  6.4 本章小结  106-107
  参考文献  107-109
第七章 银杏抗氧化肽的固相合成及抗氧化活性验证  109-122
  7.1 材料与方法  109-111
    7.1.1 试验材料与试剂  109-110
    7.1.2 试验仪器  110
    7.1.3 试验方法  110-111
  7.2 结果与分析  111-118
    7.2.1 合成抗氧化肽YVGD和LGNTDYAVH的纯度及质谱鉴定  111-113
    7.2.2 二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)清除能力的测定  113-114
    7.2.3 羟自由基(·OH)清除能力的测定  114-115
    7.2.4 超氧阴离子自由基(O_2~-·)清除能力的测定  115
    7.2.5 H_2O_2清除能力的测定  115-116
    7.2.6 亚油酸体系中抗氧化能力的检测—硫氰酸铁法  116
    7.2.7 螯合金属离子能力的测定  116-117
    7.2.8 还原能力的测定  117
    7.2.9 抑制H_2O_2诱导的小鼠红细胞溶血实验  117-118
    7.2.10 抑制肝脂质过氧化试验  118
  7.3 讨论  118-119
  7.4 本章小结  119-120
  参考文献  120-122
全文结论  122-124
创新之处  124-125
附录  125-126
详细摘要  126-132

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中图分类: > 农业科学 > 林业 > 森林树种 > 阔叶乔木 > 银杏
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