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第一部分丙酮酸乙酯对肝脏L-02细胞缺氧/复氧损伤的保护机制研究目的：探索EP对肝脏L-02细胞缺氧/复氧损伤的保护作用和机制。方法：肝脏L-02细胞系根据干预措施分为三组,非干预组(Control组)、乳酸钠林格式液组(LR组)、丙酮酸乙酯组(EP组),放入Billups-Rothenberg缺氧装置,缺氧60Min,再复氧1 hr；应用不同浓度的EP溶液进行干预, HO/PI技术确定最佳实验浓度；细胞悬液AST和ALT；采用HO/PI技术双标记荧光染色法观察各组细胞凋亡和坏死情况,并在荧光显微镜下计数;流式细胞仪观察各组细胞凋亡和坏死情况；Western blot方法检测各组细胞悬液HMGB1的表达,计算光密度值；Western blot方法检测各组Caspase9, Caspase3, PARP的表达,计算光密度值；透射电子显微镜观察细胞超微结构,线粒体结构；应用荧光素发光法测量各组肝细胞内ATP浓度。结果：观察缺氧/复氧肝细胞在EP浓度分别为1、2和5mmol/L情况下凋亡和坏死情况,结果显示,2mMEP浓度下肝细胞坏死比例低于其它浓度组,P值<0.05。检测细胞悬液AST和ALT,EP组分别为34.6±0.5 IU/L和28.5±0.6 IU/L,低于LR组和Control组,P值<0.05。应用HO/PI双染技术,观察缺氧/复氧肝细胞各组凋亡和坏死情况,结果显示,EP组活细胞比例高于另外两组,P值>0.05；EP组坏死细胞比例低于另外两组,P值<0.05;EP组凋亡细胞比例高于另外两组,P值<0.05。采用流式细胞仪术检测缺氧/复氧肝细胞在各组凋亡和坏死,EP组坏死细胞比例减少,凋亡细胞比例增加,与Control组、LR组相比差异有显著性,P值<0.05。Western blot方法检测HMGB1, EP组光密度值0.40±0.05,低于另外两组,P值<0.05。通过Western法检测凋亡相关因子Caspase9, Caspase3, PARP蛋白的表达,EP组Caspase9, Caspase3, PARP蛋白的光密度值分别为0.92±0.01,0.25±0.02,和0.87±0.01,较另外两组表达明显,P值<0.05。通过电镜的检测,发现各组受损肝细胞内线粒体均有不同程度的损害,胀大,甚至成空泡状。采用荧光素发光法,检测各组肝细胞内的ATP浓度,Control组细胞内ATP浓度为1.78±0.3μmol/g, LR组细胞内ATP浓度为1.73±0.4μmol/g, EP组细胞内ATP浓度为3.476±0.5μmol/g,P值<0.05。结论：EP对肝脏L-02细胞缺氧/复氧损伤有保护作用；EP减少了肝脏L-02细胞缺氧/复氧损伤的坏死细胞数量,凋亡细胞数量增加;EP提高细胞内ATP水平,可能通过“凋亡/坏死共同通路”激活凋亡过程,减少坏死细胞,进而降低内源性损伤物质的表达,发挥了保护作用。第二部分丙酮酸乙酯对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护机制研究目的：探索EP对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用和机制。方法：建立SD大鼠缺血再灌注损伤模型。分sham组、LR组和EP组三组。分别在再灌注0,1,3,6小时,采血监测大鼠体内的AST和ALT浓度,确定IRI后损伤高峰时相和EP的保护作用。通过HE/TUNEL技术从形态学角度判断缺血再灌注肝脏组织坏死细胞和凋亡细胞的情况,在高倍镜下进行计数。通过Western blot法检测凋亡相关因子Caspase9, Caspase3, PARP的表达,计算光密度值。采用荧光素发光法,检测了各组别肝组织内的ATP水平。结果：监测大鼠体内的AST和ALT浓度,LR组和EP组在再灌注后3小时后,AST浓度分别为2773.4±16.4 IU/L和1436.4±15.2IU/L, ALT浓度分别为2356.3±15.4 IU/L和964±9.7 IU/L,均高于其它时间点血样结果,P值<0.05,提示再灌注后3小时,肝脏损伤最明显；同时再灌注后3小时,EP组AST和ALT浓度低于LR组,P值<0.05。HE/TUNEL从形态学角度判断缺血再灌注肝脏组织坏死细胞和凋亡细胞,LR组坏死细胞比例占45±0.4%,EP组坏死细胞比例占22±0.3%,P值<0.05；LR组凋亡细胞比例占0.610±0.01%,EP组凋亡细胞比例占0.449±0.02%,P值>0.05；LR组凋亡/坏死比为0.014,EP组凋亡/坏死比为0.020,P值<0.05。Western blot法检测凋亡相关因子Caspase9, Caspase3, PARP的表达,EP组Caspase9, Caspase3, PARP蛋白的光密度值分别为1.32±0.04,2.5±0.06,和3.27±0.05,较另外两组表达明显,p值<0.05。荧光素发光法,检测了各组别肝组织内的ATP水平,Sham组细胞内ATP浓度为3.82±0.5μmol/g, LR组细胞内ATP浓度为1.79±0.3μmol/g, EP组细胞内ATP浓度为2.76±0.4μmol/g, EP组高于LR组,P值<0.05。结论：EP对大鼠肝脏缺血再灌注损伤有保护作用；EP减少了大鼠肝脏缺血再灌注损伤的坏死细胞数量,凋亡细胞数量相对增加;EP提高细胞内ATP水平,可能通过“凋亡/坏死共同通路”激活凋亡过程,减少坏死细胞,进而降低内源性损伤物质的表达,发挥了保护作用。
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