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日本血吸虫四跨膜蛋白2大亲水区（Sj TSP_2HD）表达及免疫保护性的研究

作　者: 李健
导　师: 余传信
学　校: 江苏省血吸虫病防治研究所
专　业: 病原生物学
关键词: 日本血吸虫病重组融合蛋白跨膜蛋白基因工程疫苗表位硕士学位论文曼氏血吸虫血吸虫感染免疫原性重组质粒
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

血吸虫病是一种威胁全世界近6亿人身体健康的严重寄生虫病,主要在热带与亚热带地区流行。全球感染血吸虫的人口近2亿,患者2 000万左右。我国是日本血吸虫病严重流行的国家之一。目前,治疗血吸虫病的主要方法依然是以吡喹酮化疗为主的综合防治措施。药物治疗虽能降低血吸虫感染度,却不能阻断传播,再次接触疫水后会再度感染。由于反复化疗,曼氏血吸虫已经出现了吡喹酮抗药性,日本血吸虫尚不能排除今后会出现抗药性的可能。重复化疗和长期监测需要耗费大量的人力、物力和财力。因此,急需发展一种预防血吸虫病的有效方法。疫苗是防治传染病的有效手段,历史上许多烈性传染病（如天花、脊髓灰质炎）的控制均依赖于高效疫苗的应用。作为一种相对廉价且长效的防治措施,血吸虫病疫苗一直是科研工作者们追求的目标。上世纪九十年代,世界卫生组织已把发展血吸虫病疫苗确定为血吸虫病防治的优先发展战略。分子生物学、分子免疫学和生物信息学的发展,为疫苗的研制提供了极其有效的研究手段,疫苗的研究方式已由传统的减毒活疫苗或死疫苗（灭活疫苗）发展到基因工程疫苗,进而发展到近年来的核酸疫苗。经过长期的不懈努力,研究人员运用分子生物学和免疫学等方法对血吸虫病疫苗候选分子进行了大量实验研究,确定了一些较有希望的疫苗候选分子:如谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、副肌球蛋白（PM）、磷酸丙糖异构酶（TPI）、23 kDa膜蛋白（23 kDa Membrane Protein）、脂肪酸结合蛋白（FABP）、照射减毒抗原（Irv5）、信号蛋白14-3-3（Signal protein 14-3-3）等。以小鼠为模型对上述抗原的免疫保护性进行评价,效果都不够理想,单独使用都不能达到40%以上的减虫率目标,不能满足预防血吸虫感染的需要。寻找新的高效的疫苗候选分子仍然是今后相当长时期内疫苗研究的主要任务。外分泌蛋白和膜结合蛋白是与细胞发育、增殖、激活和迁移等多种功能相关的一类蛋白,是疫苗和新药研究的潜在重要靶分子。我们曾采用信号序列捕捉方法筛选到一批带信号序列的日本血吸虫外分泌蛋白和膜结合蛋白分子基因,本研究对其中的四跨膜蛋白2（Tetraspanin2,TSP2）的大亲水区肽段的基因（Sj TSP₂HD）进行了基因合成,蛋白质表达及抗血吸虫感染免疫保护性作用研究。研究包括以下三部分内容:1.日本血吸虫四跨膜蛋白2大亲水区（Sj TSP₂HD）基因合成与鉴定采用信号序列捕捉方法获得日本血吸虫四跨膜蛋白2（TSP2）基因的部分序列搜索日本血吸虫EST库,获得Sj TSP2基因全长开放阅读框序列。根据TSP2大亲水区核苷酸序列设计8条末端互补的寡核苷酸片段（每条长50bp）,并进行化学合成。以此8条寡核苷酸片段为引物进行Overlapping PCR,获得长度为246 bp的Sj TSP₂HD DNA片段。将合成的DNA片段插入到TA克隆载体pGEM-T中并进行DNA序列分析。测序结果显示合成的DNA序列与天然基因序列完全一致,表明本研究的Sj TSP₂HD基因合成获得成功。2.Sj TSP₂HD的原核构建、表达、纯化与免疫原性分析将Sj TSP₂HD DNA片段定向克隆到表达载体pGEX-4T-3的谷胱苷肽-S-转移酶（GST）下游,构建重组表达质粒TSP₂HD/pG。将重组质粒TSP₂HD/pG转化到表达宿主菌E.coli BL21（DE3）中获得含此重组质粒的转化子菌株。经IPTG诱导,转化子细菌能表达出分子量（Mr）约34 kDa的重组GST-TSP₂HD融合蛋白。用Glutathione sepharose 4B胶对该重组融合蛋白进行纯化,获得纯化的重组GST-TSP₂HD融合蛋白,用凝血酶对重组GST-TSP₂HD融合蛋白进行切割,获得纯化的TSP₂HD蛋白。Western blotting结果表明TSP₂HD蛋白可以被血吸虫病人血清及重感染兔血清所识别,而不被健康人及正常兔血清所识别。用重组GST-TSP₂HD融合蛋白免疫小鼠C57BL/6J可以诱导出高水平的抗TSP₂HD蛋白的特异性IgG,表明重组TSP₂HD蛋白具有良好的免疫原性。3.重组GST-TSP₂HD融合蛋白的动物保护性试验以30只C57BL/6J雌性小鼠（六周龄,体重约20 g）,随机分为A、B、C三组,每组10只。其中A组为佐剂对照组,B组为GST蛋白对照组,C组为重组GST-TSP₂HD融合蛋白实验组。首次免疫每只小鼠经背部皮下多点注射完全弗氏佐剂抗原100μl（含100μg抗原）,每隔2W加强免疫1次,共加强免疫2次,加强免疫用同剂量的不完全弗氏佐剂抗原。末次免疫2W后小鼠经腹部贴片感染日本血吸虫尾蚴45±2条。感染42 d后剖杀,计算减虫率和减卵率。首次免疫前2d及感染前2d分别经尾静脉采血,分离血清,通过酶联免疫吸附法检测抗体IgG及其亚类（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3）水平。取小鼠肝组织制作石蜡切片,观察小鼠肝脏的病理变化。结果显示,融合蛋白实验组与佐剂对照组、GST蛋白对照组相比,分别获得27.10%和39.57%的减虫率,32.30%和43.53%的减卵率及27.08%和40.53%的单个虫卵肉芽肿平均直径减少率。重组融合蛋白实验组小鼠的抗TSP₂HD特异性IgG抗体水平明显高于佐剂对照组和GST蛋白对照组,其中IgG1、IgG2b、IgG2c亚类抗体水平升高最为明显。研究结果表明重组TSP₂HD蛋白能诱导较高水平的抗血吸虫感染保护性作用。

全文目录

一.摘要  4-11
  1 中文摘要  4-7
  2 英文摘要  7-11
二.前言  11-15
三.研究内容  15-53
  第一部分:日本血吸虫四跨膜蛋白大亲水区(Sj TSP_2HD)基因合成与鉴定  15-28
    材料与方法  15-23
    结果  23-26
    讨论  26-28
  第二部分:Sj TSP_2HD的原核构建、表达、纯化与免疫原性分析  28-41
    材料与方法  28-36
    结果  36-39
    讨论  39-41
  第三部分:重组GST-TSP_2HD融合蛋白的动物保护性试验  41-53
    材料与方法  41-45
    结果  45-51
    讨论  51-53
四.结束语  53-54
五.参考文献  54-59
六.综述  59-70
七.致谢  70-71
八.附录  71-82
  1.本研究中所使用的质粒图谱  71-72
  2.本研究中重组质粒的测序结果  72
  3.硕士研究生在读期间发表的论文  72-82

日本血吸虫四跨膜蛋白2大亲水区（Sj TSP_2HD）表达及免疫保护性的研究

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