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Survivin基因siRNA表达质粒的构建及对其转染的胶质瘤细胞的影响

作　者: 石丛艳
导　师: 郭德玉
学　校: 第三军医大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: survivin基因 RNA干扰重组质粒测序胶质瘤转染转录细胞凋亡 RNAi机制
分类号: R739.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

背景:Survivin特异地在肿瘤组织中过表达,尤其在胶质瘤中高表达。许多报道表明抑制它的功能对肿瘤治疗有利。RNA干扰被证明是一项能有效而特异地抑制基因表达的新技术,目前已成为肿瘤基因治疗研究的热点。目的:利用RNA干扰(RNAi)技术,以survivin为靶基因,设计构建siRNA表达质粒,进行测序鉴定,并检测该表达质粒对胶质瘤细胞survivin基因表达的影响,为进一步研究survivin基因在胶质瘤发生发展中的作用以及以survivin为靶点的胶质瘤的治疗奠定基础。方法:1.设计具有短发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pSilencer3.1-H1-hygro中构建重组质粒,转化DH5α菌株,经菌落PCR鉴定后,提取质粒行酶切鉴定,并进行序列测定。2.利用构建成功的siRNA表达质粒,通过脂质体介导转染胶质瘤细胞株U87细胞,并通过RT-PCR、Western blot检测细胞中survivin mRNA和蛋白的表达。结果:1.重组质粒转化DH5α菌株经氨卞青霉素抗性筛选可见有细菌克隆长出。2.菌落PCR鉴定,证明重组质粒中有明显目的条带。3.单酶切鉴定显示重组质粒含有BglⅡ酶切位点。4.测序鉴定表明重组质粒中含有survivin基因的目的序列。5.利用构建成功的三种siRNA表达质粒,通过脂质体介导,分别与pIRES2-EGFP共转染胶质瘤细胞株U87细胞,在荧光显微镜下观察转染效果,可见U87细胞胞浆内有绿色荧光,即脂质体介导的该构建质粒与pIRES2-EGFP共转染U87细胞成功。6. RT-PCR检测细胞中survivin mRNA的表达水平,显示pSilencer3.1-H1-hygro- siRNA1可明显降低U87细胞中survivin mRNA的表达。

Survivin基因siRNA表达质粒的构建及对其转染的胶质瘤细胞的影响

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