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DNA甲基转移酶1在同型半胱氨酸致人脐静脉平滑肌细胞增殖中的作用研究

作　者: 刘玲娟
导　师: 李桂忠
学　校: 宁夏医科大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 重组质粒pcDNA3.1-DNMT1 动脉粥样硬化 同型半胱氨酸 DNA甲基化 基因转染
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的:采用基因重组真核表达质粒pcDNA3.1-DNMT1的方法,观察转染DNMT1基因后的表达的变化,探讨重组质粒pcDNA3.1-DNMT1是否可以作为靶点影响Hcy引起人脐静脉平滑肌细胞(HUVSMC)增殖,为临床治疗和预防动脉粥样硬化(AS)奠定基础。方法:1.重组质粒pcDNA3.1-DNMT1的构建:抽提HUVSMC中的总RNA,通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)合成DNMT1基因,用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ酶切质粒pcDNA3.1(+)和DNMT1基因,琼脂糖凝胶回收线性化质粒pcDNA3.1(+)和目的基因,纯化后回收产物进行连接,将连接产物转化到大肠杆菌DH5α,摇菌扩增,提取阳性重组质粒,行酶切及DNA测序鉴定。2.重组质粒pcDNA3.1-DNMT1转染平滑肌细胞:按阳离子脂质体Lipofectamine 2000说明操作,分为三组:①转染pcDNA3.1-DNMT1质粒组;②转染质粒pcDNA3.1(+)组;③对照组(正常的HUVSMC)。免疫荧光法检测重组质粒在平滑肌细胞中的表达。再以G418(400μg/mL)筛选两周后进行试验。3.重组质粒pcDNA3.1-DNMT1对Hcy致HUVSMC增殖的影响:将重组质粒pcDNA3.1-DNMT1转染到HUVSMC中,分为3组(n=6):正常平滑肌细胞组(CON组)、100μmol/L Hcy刺激组(Hcy组)、100μmol/L Hcy刺激+重组质粒pcDNA3.1-DNMT1转染组(Hcy+DNMT1组)。然后用细胞计数法、MTT法绘制细胞生长曲线,检测平滑肌细胞的增殖情况,并用RT-PCR检测DNMT1基因的表达量。结果:1.成功构建重组质粒pcDNA3.1-DNMT1:构建的重组质粒pcDNA3.1(+)- DNMT1酶切后能够得到预期的片段,证实其正确性;经生物公司测序所得结果与GenBank公布的序列进行BLAST比对,同源性为100%。2.重组质粒pcDNA3.1-DNMT1的转染:在荧光显微镜下观察,重组质粒转染HUVSMC后可见绿色荧光,而其他两组没有。3.重组质粒pcDNA3.1-DNMT1转染入HUVSMC对Hcy致HUVSMC增殖有抑制作用:生长实验显示Hcy组较CON组平滑肌细胞生长速度增快(P<0.05),Hcy+DNMT1组较Hcy组平滑肌细胞生长速度减慢(P<0.05)。说明转染重组质粒pcDNA3.1-DNMT1后可能对Hcy致HUVSMC增殖起抑制作用。RT-PCR实验结果显示Hcy组较CON组DNMT1mRNA表达含量低(P<0.05),而Hcy+DNMT1组较Hcy组DNMT1 mRNA表达含量高(P<0.05)。说明Hcy作用可以导致平滑肌细胞DNMT1mRNA表达含量下降,重组质粒pcDNA3.1-DNMT1转染Hcy致HUVSMC增殖的模型后可能使DNMT1 mRNA表达含量增高。结论:1.成功构建重组表达质粒pcDNA3.1-DNMT1。2.成功将重组质粒pcDNA3.1-DNMT1转染入HUVSMC。3.转染重组质粒pcDNA3.1-DNMT1对Hcy致HUVSMC增殖有抑制作用。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-12
前言  12-14
第一部分 人脐静脉平滑肌细胞的培养  14-20
  材料和方法  14-18
  实验结果  18-19
  讨论  19-20
第二部分 构建重组质粒pcDNA3.1-DNMT1  20-41
  材料和方法  20-32
  实验结果  32-33
  讨论  33-36
  附图  36-41
第三部分 重组质粒pcDNA3.1-DNMT1 转染人HUVSMC  41-47
  材料和试剂  41-42
  实验方法  42-44
  实验结果  44-45
  讨论  45-47
第四部分 重组质粒pcDNA3.1-DNMT1 对Hcy 致HUVSMC 增殖的影响  47-57
  材料和方法  47-51
  实验结果  51-54
  讨论  54-57
结论  57-58
参考文献  58-63
综述  63-77
  综述参考文献  72-77
致谢  77-78
攻读学位期间发表的学术论文  78-79
个人简历  79

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生物化学、分子生物学
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