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旋毛虫Ts87基因重组质粒的构建及在体外真核细胞中的表达

作　者: 徐旭娜
导　师: 张路平；诸欣平
学　校: 河北师范大学
专　业: 动物学
关键词: 旋毛虫 DNA疫苗重组质粒真核表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
下　载: 75次
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内容摘要

旋毛虫病是一种世界范围的人畜共患寄生虫病。本病给国民经济和人类健康造成极大危害。旋毛虫病的诊断和治疗都比较困难，因而预防显得尤为重要。由于旋毛虫生活史的复杂性和抗原的多样性，虽然近年来许多学者进行了多方面的研究，但迄今为止，尚未发现免疫预防旋毛虫病的有效措施。 DNA疫苗是90年代发展起来的一项新型疫苗技术。该技术将含有外源蛋白编码序列的质粒DNA注入某种动物，外源蛋白可以在体内直接表达并持续刺激机体产生免疫应答。它不但可以产生保护性体液免疫，并且可以诱发强烈的细胞毒性T细胞反应，因此普遍认为，DNA疫苗极具发展潜力，它的问世将为免疫预防旋毛虫病提供新的途径。本实验的目的是按照研制核酸疫苗的技术路线，构建目的基因的重组质粒，将之转染哺乳动物细胞并检测相应蛋白的表达，最终为旋毛虫DNA疫苗的体内实验奠定基础。本研究采用通过免疫筛库得到的旋毛虫抗原基因片段Ts87与载体pCDNA3.1连接。该载体含有人类巨细胞病毒(CMV)的高效启动子和增强子，是一种外源基因在哺乳动物细胞内高效表达的理想载体。通过重新设计引物在Ts87两端加上用于构建重组质粒的酶切位点HindⅢ和BamH Ⅰ和用于真核表达的KOZAK序列。将改造后的基因片段克隆入T-Vector，转化大肠杆菌DH5α，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆后测序鉴定。然后将目的片段与真核表达载体pCDNA3.1连接，构建重组质粒pCDNA3.1／Ts87，同样经过转化和筛选，获得阳性克隆，并用PCR和质粒酶切的方法鉴定。pCDNA3.1／Ts87由脂质体lipofectamine介导，转染COS7细胞。通过细胞的免疫组化，细胞裂解物的SDS-PAGE电泳，Westem-blot分析检测目的基因的表达情况。免疫组化结果显示：重组质粒转染的细胞质中有棕褐色颗粒，而空载体转染细胞及正常细胞无此现象；细胞裂解物SDS-PAGE电泳结果显示：只有重组质粒转染的细胞在约38KD处有明显的蛋白带，这与理论计算的Ts87基因表达蛋白的分子量为38KD基本一致；Western-blot分析结果显示：约38KD的蛋白带能够分别被旋毛虫感染兔血清，成虫虫体可溶性抗原免疫兔血清，Ts87基因原核表达蛋白免疫兔血清(Ts87血清)以及一株具保护性的旋毛虫单抗特异识别。摘要旋毛虫TS87基因重组质粒的构建及在体外真核细胞中的表达2 总之，该实验成功构建了旋毛虫pCDNA3．l／Ts87重组质粒，并在体外真核细胞中成功表达，为进一步体内实验提供了有力依据。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-8
文献综述  8-20
正文前言  20-23
实验方法  23-37
实验结果  37-44
讨论  44-49
结论  49-50
参考文献  50-62

旋毛虫Ts87基因重组质粒的构建及在体外真核细胞中的表达

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