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重组人FHIT真核表达质粒的构建及其干预胆管癌细胞株QBC939增殖、凋亡及侵袭性的研究

作　者: 谢放
导　师: 黄强
学　校: 安徽医科大学
专　业: 外科学
关键词: 肿瘤遗传学 FHIT 重组质粒 QBC939 Cyclin D1
分类号: R735.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


序言真核表达质粒的构建和转染是目前医学研究中常用的分子生物学手段。而肿瘤的发生与抑癌基因和癌基因密切相关。FHIT是一种重要的抑癌基因,在多种肿瘤中被发现表达缺失。Cyclin D1为常见的癌基因,它可以促使肿瘤细胞度过细胞周期的限制点,如G1/S限制点。它们的相互调控作用,尤其是FHIT干预胆管癌细胞的增殖、凋亡及侵袭性成为本次研究的重点。目的通过构建重组人脆性组氨酸三联体(FHIT)基因真核表达质粒,探讨FHIT基因对胆管癌细胞株QBC939增殖、凋亡及侵袭性的影响,并进一步研究FHIT基因对细胞周期蛋白Cyclin D1的调控作用。方法首先通过Trizol法提取新鲜标本组织中的RNA进行RT-PCR,将产物与载体pcDNA 3.1用BamH I/Xho I双酶切纯化后相连接,构建出重组真核表达质粒,并进行序列鉴定。然后通过脂质体瞬时转染法,将构建的FHIT-pcDNA 3.1转染入QBC939细胞,挑选出新霉素抗性克隆并进行荧光定量RT-PCR鉴定。将实验对象随机分为三组:自然对照组(NCG)、空白对照组(BCG)和实验组(EPG)。分别使用MTT法检测细胞增殖情况、流式细胞仪检测细胞凋亡情况、Transwell小室侵袭实验检测侵袭能力的变化、荧光定量RT-PCR检测Cyclin D1 mRNA表达情况及Western Blot法检测Cyclin D1蛋白质表达情况。所得数据进行单因素方差分析。结果构建出了重组人FHIT真核表达质粒并经过序列鉴定。荧光定量RT-PCR检测转染后的QBC939细胞FHIT基因表达有限恢复。实验组与两个对照组比较,QBC939细胞增殖被抑制(P<0.05),促进了其凋亡,传过小室膜的细胞数量明显减少;并且Cyclin D1在基因和蛋白质水平的表达均被下调(P<0.05)。结论成功构建了重组人FHIT真核表达质粒。FHIT基因可以干预QBC939细胞的增殖和凋亡,减弱其侵袭力,并能下调Cyclin D1的表达水平。为胆管癌进一步的基础与临床研究提供了分子生物学工具和方向。

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 胆囊、胆道肿瘤
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