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单纯疱疹病毒2型gG2“独特区”基因的克隆表达及其血清学诊断的价值初探

作　者: 王茜
导　师: 曾抗；周再高
学　校: 第一军医大学
专　业: 皮肤性病学
关键词: 单纯疱疹病毒糖蛋白G-2 克隆重组质粒表达纯化
分类号: R752
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

一、研究意义和目的单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)属于疱疹病毒科a病毒亚科，病毒颗粒大小约180纳米。根据抗原性的差别目前把该病毒分为1型和2型。人群中HSV感染较为普遍，人是疱疹病毒的自然宿主。HSV-2型主要与外生殖器感染及新生儿感染有关，可引起生殖器疱疹、新生儿疱疹。通过医学界近年来多方面的研究表明HSV-2与宫颈癌发生有关，并且增加了AIDS的感染机会。据1992年统计，美国每年有1200多万STD新患者，生殖器疱疹病毒感染近20年增加15倍，累计人数超过2000万，跃升为最流行的STD之一。从STD发展趋势看，病毒和衣原体感染引起的STD比传统的性病显得更为重要，称为第二代STD。如果说以前对传统的性病易于治疗的话，那么对日益剧增的第二代STD病原体，尤其是病毒性STD，其危害性不仅表现在诊断、治疗上困难增大，而且并发症和后遗症也更为严重，直接威胁人类的生命健康。生殖器疱疹的临床表现多种多样，可表现为典型的水疱和糜烂，但不典型和亚临床感染者更为多见，后者易被人们所忽视，成为重要的感染源。目前对于单纯疱疹病毒感染的检测手段有限，血清学方法标准的补体结合技术不能鉴别HSV-1和HSV-2，传统的病毒培养法费时费力。我们旨在建立基于HSV型特异的糖蛋白G(gG)的检测HSV血清抗体的蛋白印迹试验疫吸附试验，为临床中单纯疱疹病毒的感染提供更快、更有效及明确的诊断方法。大量研究表明，HSV病毒颗粒中有至少12种胞膜糖蛋白(glycoprotein g)，gB、gC、gD、gE／gI、gG、gH／gL、gK、gM／gN、gJ。其中gG携带有HSV型特异抗原决定簇，gG-2在单纯疱疹2型病毒诊断、分型、疫苗研究中有举足轻重的地位。gG-2由US4编码，基因片段长度为2100bp，可以编码699个氨基酸的蛋白质。本研究分析了单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白G-1和单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白G-2的B细胞抗原表位，并用信息学软件比较了两者之间的基因差异。研究发现HSV-2的gG-2基因全长中包括一个与HSV-1的gG-1基因高度同源的区域和一个“独特区”。gG-1基因和gG-2基因在“独特区”中的同源性非常低。对gG-2蛋白的B细胞抗原表位预测发现，在gG-2蛋白中存在7段抗原指数以及表面可能性强的肽段相对集中区域。另有研究者发现，HSV-2的gG-2基因序列抗原区域极少突变，即使出现了点突变也不会削弱gG-2的血清学活性。该报告进一步证实gG-2基因可以作为型特异性抗原，同时指出gG-2基因的保守性是作为HSV-2特异疫苗成分的先决条件。因此，本研究将靶蛋白抗原锁定为gG-2的“独特区”(gG-2_T)。对单纯疱疹病毒gG-2_T进行扩增、克隆。在原核系统中表达，并对表达蛋白的蛋白进行纯化，对其抗原活性进行初步研究。二、研究方法和内容1、从临床确诊病人水疱部位取材、分离病毒并在Vero细胞中培养。2、根据GenBank提供的单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白G-2的基因组序列，设计扩增引物，上游的引物序列是“5′GAATTCatggcacgacccacggaagacg-3′”；下游的引物序列是5′-CTCGAG cggggttgcgggtccgg-3′。以Vero细胞病毒培养液上清提取的DNA为模板，扩增gG-2基因，构建克隆载体pGEM-T-G2，通过PCR鉴定。3、从GenBank中下载单纯疱疹病毒1型糖蛋白G-1序列，输入LaserGene软件包中的Editseq软件中，截取gG-1基因片段，翻译成氨基酸序列。利用Clustal X软件将扩增的gG-2基因与下载的gG-1基因片段核苷酸和氨基酸序列进行比较。利用Proetean和DNAMAN软件对单纯疱疹病毒1型和2型的糖蛋白G进行抗原表位、α螺旋中心以及疏水区域进行预测，并比较它们之间的差异4、根据序列分析结果，选定gG-2_T为目的序列。根据单纯疱疹病毒333株gG-2基因序列设计引物，在引物两端加上EcoRⅠ／XhoⅠ限制性内切酶位点。以pGEM-T-G2质粒为模板扩增gG-2_T，得到pGEM-T-gG-2_T重组克隆载体。5、将pGEX-4T-1载体与pGEM-T-gG-2_T分别经过EcoRⅠ／XhoⅠ双酶切后连接，构建融合表达载体pGEX-4T-1-gG-2_T，转化宿主菌BL21，通过双酶切，PCR方法鉴定后测序。6、利用IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳及Western-blot分析对表达蛋白进行初步鉴定。7、优化表达条件。将目的蛋白于上清表达，并使用GST亲和纯化试剂盒进行表达蛋白的纯化。8、利用纯化蛋白与单纯疱疹病毒1型、2型病人血清以及正常人血清进行Western blotting、间接EHSA反应。三、研究结果1、Vero细胞变性，病毒成功地在Vero细胞中扩增。2、提取病毒DNA，扩增单纯疱疹病毒2型gG-2基因，gG-2基因全长2100bp，与单纯疱疹病毒2型333株gG-2基因同源性为99.5％。以gG-2基因为模板，扩增并克隆gG-2_T区，gG-2_T区序列大小为591bp，编码197个氨基酸。3、利用生物信息学软件对Poly-Kyte-Doolittl亲水性、Polt-Emini表面可能性、Jameson-Wolf抗原指数三参数综合预测，结果显示，HSV-2-G2蛋白C端的抗原指数较强。4、通过优化表达条件，pGEX-4T-1-gG-2_T可在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白，分子量约为46KD。通过超声裂解，表达的融合蛋白以上清的形式溶解在裂解液中。融合蛋白含有GST标签，可以通过GST亲和纯化柱进行纯化。5、通过调整优化条件，获得纯度较高的重组表达蛋白gG-2_T。蛋白的纯化纯度大于95％。6、纯化的目的蛋白能与GST多克隆抗体发生反应，能与单纯疱疹病毒2型病人血清反应，而不与单纯疱疹病毒1型病人血清发应。故通过实验得到我们需要的目的蛋白。四、研究结论鉴于预防、检测和治疗HSV感染的重要性，研制新型特异性诊断试剂盒以及开发疫苗是目前诊断和预防单纯疱疹病毒感染的最可行有效的方法。前者能快速准确诊断、鉴别初次感染和再次感染、用于大规模HSV感染的流行病筛查，后者能使机体在抗HSV感染免疫中，发挥体液免疫和细胞免疫功能来消除HSV感染。HSV-2包膜糖蛋白gG-2基因全长为2100bp，由US4基因编码699个密码子，包括一个与HSV-1包膜糖蛋白gG-1基因高度同源的区域和一个“独特区”。通过对gG-1蛋白和gG-2蛋白的比对以及B细胞抗原表位的预测我们发现，gG-1基因和gG-2基因在“独特区”中的同源性非常低。Grabowsk等人利用噬菌体展示技术发现两个位于gG-2“独特区”内的免疫显位在氨基酸残基的351-427、525-587内，并通过试验证明这两段氨基酸残基只与HSV-2型单纯疱疹病毒反应而不予HSV-1型单纯疱疹病毒反应。Ikoma等利用杆状病毒表达系统表达gG-2(281aa～594aa)，检测HSV-2型感染病人血清特异性抗体，特异性和敏感性达到95.5％。由此说明这两段区域的肽段适合用作临床抗体检测，尤其适合用作HSV-2分型诊断。研究发现，HSV-2的gG-2基因序列抗原区域极少突变，即使出现了点突变也不会削弱gG-2的血清学活性。该报告进一步证实gG-2基因可以作为型特异性抗原，同时指出gG-2基因的保守性是作为HSV-2特异疫苗成分的先决条件。本文采用分子克隆及基因重组技术成功构建出HSV-2型gG-2_T(285～482aa)基因片段，利用原核表达载体表达出含有gG-2_T的融合蛋白，通过Western-Blot免疫印迹检测表达蛋白能与GST多克隆抗体特异性结合。纯化的蛋白即为我们需要的目的蛋白。间接ELISA证明表达的蛋白能够与HSV-2阳性病人反应而不与正常人血清和HSV-1病人血清反应，表明原核表达的蛋白具有一定的免疫学活性。以上研究为单纯疱疹病毒2型感染的型特异性诊断试剂盒的研发，生殖器疱疹筛查、型特异性疫苗研究寻找更好的靶位点提供参考。

全文目录

摘要  3-8
ABSTRACT  8-16
第一部分单纯疱疹病毒2型糖蛋白gG-2基因序列测定及分析  16-29
  1.1 材料  16-18
  1.2 实验方法  18-22
    1.2.1 细胞培养分离病毒  18
    1.2.2 引物设计与合成  18
    1.2.3 单纯疱疹病毒DNA提取  18-19
    1.2.4 目的基因扩增与纯化  19-20
    1.2.5 目的基因克隆  20-21
    1.2.6 gG-2基因的序列测定及同源性分析  21-22
    1.2.7 gG-2基因与gG-1基因的生物信息学分析及比较  22
  结果  22-25
  讨论  25-28
  小结  28-29
第二部分单纯疱疹病毒2型gG-2“独特区”重组表达质粒的构建及鉴定  29-43
  2.1 材料  29-30
  2.2 实验方法  30-37
    2.2.1 gG2独特区片段的获取  30-31
    2.2.2 目的基因克隆  31
    2.2.3 酶切及鉴定  31-32
    2.2.4 表达载体的构建  32-35
    2.2.5 阳性克隆pGEX4T-1／T的诱导表达及鉴定  35
    2.2.6 免疫印迹(Western-Blot)检测表达蛋白  35-37
  结果  37-40
  讨论  40-41
  小结  41-43
第三部分单纯疱疹病毒2型gG-2_T蛋白纯化以及抗原活性初步研究  43-51
  3.1 材料  43-44
  3.2 实验方法  44-47
    3.2.1 目的基因表达条件的优化  44
    3.2.2 超声裂解条件的优化  44
    3.2.3 表达产物的纯化  44-46
    3.2.4 阳性HSV-2型、HSV-1型病人血清的确定  46
    3.2.5 间接ELISA检测纯化蛋白免疫原性  46
    3.2.6 间接EHSA检测纯化蛋白与HSV-1型的交叉反应  46-47
  结果  47-49
  讨论  49-50
  小结  50-51
参考文献  51-55
综述  55-61
攻读学位期间成果  61-62
缩略语词汇表  62-64
致谢  64-65

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