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含Hsp70的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5及N蛋白基因的核酸疫苗构建及免疫研究

作　者: 曾晖
导　师: 颜其贵；郭万柱
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: PRRSV 分子佐剂 重组质粒 核酸疫苗
分类号: S852.659.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


本试验根据Genbank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因、ORF7基因和结核分枝杆菌Hsp70基因设计合成特异性引物,以本实验室保存的PRRSV-SCQ株提取其总RNA为模板,RT-PCR扩增出369bp的目的片段ORF7A(含终止子)和ORF7B,并克隆到pMD19-T载体中；以本实验室构建的pMD18-T-ORF5和pMD18-T-Hsp70为模板,PCR扩增出516bp和1878bp的目的片段ORF5和Hsp70,其分别克隆到pMD19-T上；扩增PRRSV-SCQ株ORF7A和ORF7B基因分别插入pMD19-T-ORF5中,得到T-ORF5-ORF7A和T-ORF5-ORF7B。将两者克隆到pCI-neo上,获得pCI-ORF5-ORF7A和pCI-ORF5-ORF7B;再将Hsp70插入pCI-ORF5-ORF7B,构建出重组质粒pCI-ORF5-ORF7B-Hsp70。将pCI-ORF5-ORF7B-Hsp70 DNA疫苗免疫健康小白鼠,同时设立pCI-ORF5-ORF7A DNA、pCI-neo DNA、PRRS弱毒疫苗、生理盐水4个对照组,断尾采血并检测ORF5、ORF7和Hsp70的mRNA转录、蛋白表达、细胞因子IFN-Y和IL-4水平以及T淋巴细胞亚群变化。结果显示如下：1、通过质粒的重复测序表明,本研究成功构建了重组质粒pCI-ORF5-ORF7A和pCI-ORF5-ORF7B-Hsp70.2、真核重组表达质粒pCI-ORF5-ORF7A和pCI-ORF5-ORF7B-Hsp70分别接种小鼠14d后,在小鼠外周血(经DNase处理)中均能检测到ORF5和ORF7基因的mRNA;在接种过pCI-ORF5-ORF7B-Hsp70的小鼠外周血(经DNase处理)中可扩增出Hsp70基因的mRNA,表明重组DNA在小鼠体内得到了有效转录。3、重组质粒PCI-ORF5-ORF7B-Hsp70免疫小鼠后,14d、21d、28d、35d、42d时,用ELISA试剂盒检测血清中PRRSV特异性抗体水平,该组抗体水平高于pCI-ORF5-ORF7A组和PRRS弱毒疫苗组,其28d抗体水平(OD630值为0.875)达到峰值,42d抗体水平(OD630值为0.782)有所回落；极显著大于pCI-ORF5-ORF7A组,显著(p<0.05)大于PRRS弱毒疫苗组。4、使用ELISA试剂盒在35d时检测IFN-γ和IL-4,pCI-ORF5-ORF7B-Hsp70组的IFN-γ(196.35pg/mL)和IL-4(53.27pg/mL)分泌水平最高；极显著(p<0.01)大于pCI-ORF5-ORF7A组；显著(p<0.05)大于PRRS弱毒疫苗组；而pCI-neo组和生理盐水组分泌IFN-γ和IL-4水平均很低。5、使用流式细胞仪检测小鼠外周血T淋巴细胞亚群：pCI-ORF5-ORF7B-Hsp70组的小鼠外周血T细胞CD3+水平(78.39%)最高,极显著(p<0.01)大于pCI-ORF5-ORF7A组和PRRS弱毒疫苗组；CD4+水平(51.72%)同样最高,极显著(p<0.01)大于pCI-ORF5-ORF7A组,显著(p<0.05)大于PRRS弱毒疫苗组；CD8+水平(24.66%)与对照组相比无明显差异(p>0.05)；CD4+／CD8+比值最高,但与对照组相比差异不显著(p>0.05)。本研究所构建的以Hsp70为分子佐剂的PRRSV-ORF5-ORF7核酸疫苗能够诱导小鼠产生较好的免疫应答,为PRRS新型核酸疫苗的进一步研究提供了参考数据。

全文目录


中文摘要  3-5
Abstract  5-7
目录  7-10
第一章 文献综述  10-21
  1 PRRSV基因组与结构蛋白的特点与功能  10-17
    1.1 PRRSV基因组  10-11
    1.2 结构蛋白  11-14
      1.2.1 GP2、GP3、GP4的特点与功能  11
      1.2.2 GP5的特点与功能  11-13
      1.2.3 M蛋白特点与功能  13
      1.2.4 N蛋白特点与功能  13-14
    1.3 PRRS的防制  14-17
      1.3.1 PRRS防制的策略  14-15
      1.3.2 疫苗研究进展  15-17
  2 分子伴侣Hsp70在核酸疫苗中应用的研究  17-21
    2.1 热休克蛋白70(Hsp70)  17
    2.2 热休克蛋白70重要功能  17-19
      2.2.1 分子伴侣功能  18
      2.2.2 增强免疫反应功能  18-19
    2.3 Hsp70嵌合DNA疫苗  19
    2.4 小结  19-21
第二章 核酸疫苗的构建及鉴定  21-49
  1 材料  21-23
    1.1 载体和菌株  21
    1.2 试剂与引物  21-23
      1.2.1 主要试剂  21
      1.2.2 溶液配制  21-22
      1.2.3 引物(上海英俊公司合成)  22-23
    1.3 主要仪器  23
  2 方法  23-36
    2.1 PRRSV ORF7基因的PCR、克隆及鉴定  23-26
      2.1.1 PRRSV的总RNA的提取  23
      2.1.2 RT-PCR扩增ORF7A(含终止子)和ORF7B(不含终止子)  23-25
      2.1.3 目的基因ORF7A和ORF7B的回收  25
      2.1.4 大肠杆菌DH5a感受态细胞的制各  25
      2.1.5 ORF7A和ORF7B的连接与转化  25-26
      2.1.6 重组质粒的筛选  26
      2.1.7 序列测定  26
    2.2 PRRSV ORF5基因的PCR、克隆及鉴定  26-28
      2.2.1 pMD-PRRSV ORF5基因的PCR  27
      2.2.2 目的基因ORF5的回收  27
      2.2.3 ORF5的连接与转化  27-28
      2.2.4 重组质粒的筛选  28
      2.2.5 序列测定  28
    2.3 结核分枝杆菌Hsp70基因的PCR、克隆及鉴定  28-32
      2.3.1 pMD-Hsp70基因的PCR  28-29
      2.3.2 目的基因Hsp70的回收  29
      2.3.3 Hsp70的连接与转化  29-30
      2.3.4 重组质粒的筛选  30
      2.3.5 序列测定  30-32
    2.4 重组质粒pMD-ORF5-ORF7A和pMD-ORF5-ORF7B的构建  32-33
      2.4.1 PRRSV ORF7A和ORF7B DNA的获得  32
      2.4.2 含PRRSV ORF5基因的pMD19-T Simple开环载体的准备  32
      2.4.3 PRRSV ORF5基因分别与ORF7A及ORF7B基因的连接及转化  32-33
      2.4.4 重组质粒的筛选  33
      2.4.5 序列测定  33
    2.5 构建重组质粒pCI-ORF5-ORF7A和pCI-ORF5-ORF7B  33-35
      2.5.1 PRRSV ORF5-ORF7A和ORF5-ORF7B DNA的获得  33-34
      2.5.2 真核表达载体pCI-neo开环线性化准备  34
      2.5.3 pCI-neo分别与ORF5-ORF7A和ORF5-ORF7B的连接及转化  34
      2.5.4 重组质粒的筛选  34-35
    2.6 构建真核表达质粒pCI-ORF5-ORF7B-Hsp70  35-36
      2.6.1 结核分枝杆菌Hsp70 DNA的获得  35
      2.6.2 pCI-ORF5-ORF7B开环线性化准备  35
      2.6.3 Hsp70与pCI-ORF5-ORF7B连接及转化  35
      2.6.4 重组质粒的筛选  35-36
    2.7 重组蛋白二级结构预测  36
  3 结果与分析  36-44
    3.1 pMD-ORF7A和pMD-ORF7B的构建  36-37
      3.1.1 PRRSV ORF7基因的PCR扩增  36
      3.1.2 PCR及酶切鉴定  36-37
      3.1.3 序列测定  37
    3.2 pMD-ORF5的构建  37-38
      3.2.1 PRRSV ORF5基因的PCR扩增  37-38
      3.2.2 酶切鉴定  38
      3.2.3 序列测定  38
    3.3 结核分枝杆菌pMD-Hsp70的构建  38-39
      3.3.1 结核分枝杆菌Hsp70基因的PCR扩增  38-39
      3.3.2 酶切鉴定  39
      3.3.3 序列测定  39
    3.4 重组质粒pMD-ORF5-ORF7A和pMD-ORF5-ORF7B的构建  39-40
      3.4.1 pMD-ORF5-ORF7A和pMD-ORF5-ORF7B的PCR鉴定  39-40
      3.4.2 pMD-ORF5-ORF7A和pMD-ORF5-ORF7B的酶切鉴定  40
      3.4.3 序列测定  40
    3.5 构建重组质粒pCI-ORF5-ORF7A和pCI-ORF5-ORF7B  40-41
    3.6 构建真核表达质粒pCI-ORF5-ORF7B-Hsp70  41-42
    3.7 重组蛋白的二级结构预测结果  42-44
      3.7.1 Linker柔性分析  42
      3.7.2 表位分析  42-44
  4 讨论  44-48
    4.1 核酸疫苗的目的基因选择  44-46
    4.2 真核表达载体的选择  46-47
    4.3 核酸疫苗构建策略  47-48
  5 小结  48-49
第三章 动物免疫实验  49-61
  1 材料  49
    1.1 实验材料  49
  2 方法  49-53
    2.1 小白鼠免疫试验  49-50
      2.1.1 pCI-ORF5-ORF7A和pCI-ORF5-ORF7B-Hsp70质粒的制备  49
      2.1.2 质粒DNA的免疫  49-50
      2.1.3 血样的采集  50
    2.2 免疫试验指标检测  50-53
      2.2.1 小鼠体内mRNA表达检测  50
      2.2.2 PRRSV抗体检测  50-51
      2.2.3 T淋巴细胞亚群数量检测  51
      2.2.4 小鼠体内IFN-γ分泌水平检测  51-52
      2.2.5 小鼠体内IL-4分泌水平检测  52-53
  3 结果  53-57
    3.1 小鼠体内mRNA表达检测  53-54
    3.2 小鼠体内PRRSV抗体检测结果  54-55
    3.3 小鼠体内IFN-γ和IL-4分泌水平检测结果  55-56
    3.4 T淋巴细胞亚群CD3~+、CD4~+和CD8~+水平检测结果  56-57
  4 讨论  57-61
结论  61-62
参考文献  62-69
致谢  69-70
附录  70-74
攻读学位期间发表的学术论文  74

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学 > 正股单股RNA病毒
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