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沙田柚配子体自交不亲和花柱消减文库的构建及差异表达基因的分析

作　者: 熊军
导　师: 秦新民
学　校: 广西师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 沙田柚自交不亲和抑制性消减杂交(SSH) cDNA文库
分类号: Q943
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

沙田柚(Citrus grandis var. Shatinyu Hort.)为广西的名优水果,属典型的配子体自交不亲和植物,是研究配子体自交不亲和机理的好材料。然而严重的自交不亲和使沙田柚必须通过人工授粉才能结果,增加了生产成本。因此,研究沙田柚的自交不亲和机理具有重要生产实践价值和理论意义。本研究以沙田柚自、异交花柱为材料,构建了沙田柚自交不亲和花柱抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)正反向cDNA文库,并对表达序列标签(expressed sequence tag,EST)进行了分析研究。蓝白斑检验结果表明,正向SSH文库重组率为95%,PCR检测表明插入片段的平均长度250bp左右。随机挑选文库中的80个阳性克隆进行测序,去除测序不好的EST,共获得67条测序较好的序列,剔除37条重复序列以及去载体后少于100bp的序列,共得到差异EST序列30条。这些序列通过BLASTx和BLASTn软件对基因库(GenBank)中的非冗余(non-redundant)数据库进行序列相似性检索,其中23条通过BLASTx搜索具有明确的功能对比结果,根据预测的功能进行GO(gene ontology)分类,结果表明:10条与催化活性相关,占43.48%;3条与酶活性调节相关,占13.04%;2条与转录调控活性相关,占8.70%;另与信号传递活性、运输、及生理学途径相关的各1条,占4.35%;还有4条未作分类,占17.39%。此外,还有7条EST序列在BLASTx搜索中没有得到功能比对结果,但通过BLASTn搜索,有1条与野生种三浅裂野牵牛的自交不亲和S-位点序列(Ipomoea trifida DNA,self-incompatibility(S-) locus region,haplotype:S1)具有较高的同源性,其相似度均为88%。另1条EST序列与苹果的S9-RNase基因(Malus x domestica MdSFBB9-alpha, S9-RNase, MdSFBB9-beta genes, complete cds, Psi-SFBB9-alpha, Psi-SFBB9-beta pseudo genes)的相似度达89%,另有2条与Nicotiana benthamiana(烟草)isopentenyl /dimeth-ylallyl diphosphate isomerase(异构酶) mRNA,partial cds及Arabidopsis thaliana (拟南芥)LAS1 (Lanosterol synthase 1); catalytic/lyase (裂解酶)(LAS1) mRNA,complete cds有较高的相似度,分别为85%和87%。反向文库中,随机挑取的34个阳性克隆检测后测序,去除测序不好的EST,共获得质量较好的EST序列27条,剔除重复的序列,共得到差异EST序列24条。这些序列通过BLASTx软件对基因库(GenBank)中的非冗余(non-redundant)数据库进行序列相似性检索,搜索后均有明确的功能对比结果,根据预测的功能进行GO分类,结果表明:它们与催化活性及酶调节活性功能相关性最大,分别占29.17%,如葡萄糖基转移酶、几丁质酶、脯氨酸寡肽酶、组氨酸激酶等,其余的一些分别与细胞成分(占16.67%)、结合(占8.33%)以及生理学途径(占4.17%)等相关。综合以上研究,意味着决定沙田柚配子体自交不亲和的可能不仅仅是S等位基因,也许是许多影响因子综合作用的结果。沙田柚配子体自交不亲和花柱消减文库的构建为克隆自交不亲和相关基因,以及探讨沙田柚配子体自交不亲和机理打下良好基础。

全文目录

中文摘要  3-5
Abstract  5-11
第一章综述  11-32
  1 引言  11
  2 植物自交不亲和分子机制及研究进展  11-24
    2.1 自交不亲和性及其普遍性  11-12
    2.2 自交不亲和性的类型及表现特征  12-13
    2.3 自交不亲和性的遗传基础  13-14
    2.4 自交不亲和性的细胞生物学和生理生化研究  14-15
    2.5 自交不亲和性的分子生物学研究  15-23
      2.5.1 孢子体自交不亲和性的分子基础  15-18
      2.5.2 配子体自交不亲和性的分子基础  18-23
    2.6 沙田柚自交不亲和机制研究概况  23-24
  3 差异表达基因的研究方法  24-31
    3.1 克隆差异表达基因的常用方法  25-27
      3.1.1 mRNA 差异显示技术(DDRT-PCR)  25
      3.1.2 cDNA 扩增片段长度多态性技术(cDNA - AFLP)  25-26
      3.1.3 cDNA 代表性差示分析技术(cDNA-RAD)  26
      3.1.4 基因表达系列分析技术(SAGE)  26-27
      3.1.5 基因芯片技术  27
      3.1.6 抑制性消减杂交技术(SSH )  27
    3.2 本研究采用的抑制性消减杂交SSH 技术简介  27-31
      3.2.1 抑制性消减杂交技术原理和试验流程  27-29
      3.2.2 抑制性消减杂交技术的优缺点  29
      3.2.3 抑制性消减杂交技术应用  29-31
  4 立题意义  31
  5 技术路线  31-32
第二章材料和方法  32-48
  2.1 实验材料  32-33
    2.1.1 材料  32
    2.1.2 主要生化试剂  32
    2.1.3 试剂盒  32
    2.1.4 LB 培养基配方  32-33
    2.1.5 接头及引物  33
    2.1.6 主要仪器设备  33
  2.2 实验方法  33-47
    2.2.1 沙田柚总RNA 的提取  33-34
    2.2.2 沙田柚MRNA 的分离  34-37
    2.2.3 正反向SSH 文库的构建  37-47
  2.3 克隆产物测序  47
  2.4 获得的EST 序列与GENBANK 进行同源性比较  47-48
第三章结果与分析  48-62
  3.1 正向SSH 文库  48-54
    3.1.1 总RNA 的提取和MRNA 的分离  48
    3.1.2 双链CDNA 的合成  48
    3.1.3 双链CDNA RSAI 酶切检测  48-49
    3.1.4 接头连接检测  49-50
    3.1.5 消减杂交后两次PCR 的结果分析  50
    3.1.6 SSH 文库的质量分析  50-51
    3.1.7 EST 序列分析  51-54
  3.2 反向SSH 文库  54-62
    3.2.1 总RNA 的提取和质量分析  54-55
    3.2.2 MRNA 的质量检测  55-56
    3.2.3 双链CDNA RSAI 酶切检测  56
    3.2.4 接头连接检测  56-57
    3.2.5 消减杂交后两次PCR 的结果分析  57
    3.2.6 SSH 文库的质量分析  57-58
    3.2.7 EST 序列分析  58-62
第四章讨论  62-66
  4.1 关于抑制性消减杂交技术  62-63
    4.1.1 总RNA 的完整性  62
    4.1.2 CDNA 酶切的效率  62
    4.1.3 接头连接的高效性  62-63
  4.2 正反向文库中自交不亲和相关基因  63-64
  4.3 进一步的研究计划  64-66
第五章结论与创新点  66-67
  5.1 结论  66
  5.2 创新点  66-67
参考文献  67-77
读硕期间发表的论文  77-78
致谢  78-79

沙田柚配子体自交不亲和花柱消减文库的构建及差异表达基因的分析

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