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15个梨品种S基因型的鉴定及2个梨S基因的全长cDNA克隆

作　者: 梁文杰
导　师: 谭晓风
学　校: 中南林业科技大学
专　业: 森林培育
关键词: 梨自交不亲和 S基因型分离鉴定全长cDNA
分类号: S661.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

梨是典型的配子体自交不亲和植物,绝大多数品种自花授粉不能结实或结实率很低,生产上必需合理配置授粉树或人工授粉才能获得理想的产量。配置授粉树时首先要考虑品种的S基因型,S基因型相同的品种杂交不亲和,否则为杂交亲和。囚此确定不同品种的S基囚型将为授粉品种配置及良种选育提供重要的科学依据。为了鉴定中国梨品种的S基因型,获得中国梨新S基因的全长序列,本研究以15个中国梨品种为试验材料开展了自交不亲和性的分子生物学研究,并获得了以下结果：1.以新疆梨品种‘兰州花长把’、‘张掖长把’、‘贵德长把’,秋子梨品种‘龙香’、‘青面’、‘黄面’、‘早蜜’,白梨品种‘大面黄’、‘无籽黄’、‘大青皮’、‘金锤子’、‘半斤酥’和‘水冬瓜’,砂梨品种‘云南宝珠’、‘满顶雪’等15个品种为试验材料,分别提取基因组DNA,用特异引物’FTQQYQ’和’anti-IIWPNV’进行PCR扩增,结合DNA测序技术,鉴定了这些品种的S基因型,分别为：S19S22、S19S22、S19S22,S16SX、S1S18、S1S12、S19S29,S1S19、S28S16、S34S19、S16S19、S5S21、S15Sy,S22SX、S4S15。2.采用引物’TGCCTCGCTCTTGAACAA’和’anti-IIWPNV’对‘水冬瓜’梨的基因组DNA进行PCR扩增,从中分离鉴定了1个新的梨S基囚,即S45。S45基因信号肽、高变区、保守区1(C1)和保守区2(C2)分别由27个、15个、11个和10个氨基酸组成,且在C1区出现一处新的氨基酸替换。在推导的氨基酸水平上,S45基因和梨S26的相似性最高,但高变区有5个氨基酸差异,同时确定‘水冬瓜’梨的S基因型为S15S45。3.采用引物’TGCCTCGCTCTTGAACAA’和’anti-IIWPNV’对‘龙香’和‘云南宝珠’梨的基因组DNA进行PCR扩增,从中分离鉴定了1个新的梨S基因,即S42。经比对发现新基因与欧洲花楸的SaucS27基因相似性最高,再根据欧洲花楸的SaucS27基囚序列设计新的特异引物进行PCR扩增,从中分离了一条1044bp的序列,分析显示为梨S42的基因组全长序列,其中335bp为内含子序列,同时确定‘龙香’和‘云南宝珠’梨的S基因型分别为S16S42和S22S42。4.以‘云南宝珠’梨雌蕊为试材提取总RNA,通过RT-PCR结合RACE技术获得了梨S22和S42的全长cDNA序列。S42基因的全部编码序列为681bp,编码227个氨基酸；S42基因的全部编码序列为678bp,编码226个氨基酸。生物信息学软件分析结果表明,S22和S42两个基因都具有梨S-RNase基因的序列特征,由5个保守区和一个高变区、8个保守的半胱氨酸残基和2个保守的组氨酸残基组成。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-7
缩略词  7-12
1 绪言  12-26
  1.1 自交不亲和的类型及特点  12-13
    1.1.1 同型自交不亲和  12-13
    1.1.2 异型自交不亲和  13
    I.1.3 自交不亲和的表现形式  13
  1.2 自交不亲和性的分子基础  13-17
    1.2.1 孢子体自交不亲和性的分子基础  14-15
    1.2.2 配子体自交不亲和性的分子基础  15-17
  1.3 自交不亲和性进化的研究进展  17-18
  1.4 克服自交不亲和的方法  18-20
    1.4.1 授粉法  18-19
    1.4.2 染色体加倍  19
    1.4.3 化学处理法  19-20
    1.4.4 物理处理法  20
    1.4.5 其他克服自交不亲和的方法  20
  1.5 梨自交不亲和基因型的鉴定方法  20-23
    1.5.1 田间授粉法  21
    1.5.2 亲缘推测法  21-22
    1.5.3 花粉管伸长观测鉴定法  22
    1.5.4 生物技术鉴定法  22-23
  1.6 本研究的目的意义及技术路线  23-26
    1.6.1 目的意义  23-25
    1.6.2 技术路线  25-26
2 部分中国梨品种S基因型的鉴定  26-41
  2.1 试验材料  26-27
    2.1.1 植物材料  26
    2.1.2 主要试剂及设备  26-27
  2.2 实验方法  27-33
    2.2.1 梨基因组DNA提取及纯化  28-29
    2.2.2 梨基因组DNA检测  29-30
    2.2.3 梨S基因PCR扩增  30
    2.2.4 PCR产物的回收  30-31
    2.2.5 制备感受态细胞  31
    2.2.6 载体连接  31-32
    2.2.7 质粒转化感受态细胞  32
    2.2.8 质粒DNA抽提  32
    2.2.9 特异扩增检测  32-33
    2.2.10 序列分析  33
  2.3 结果与分析  33-40
    2.3.1 梨基因组DNA的质量检测  33-34
    2.3.2 梨S-RNase特异扩增分析  34-35
    2.3.3 测序结果分析  35-40
  2.4 小结与讨论  40-41
3 新的梨S基因的分离鉴定  41-49
  3.1 试验材料  41
    3.1.1 试验材料  41
    3.1.2 主要试剂及设备  41
  3.2 实验方法  41-42
    3.2.1 梨S基因特异扩增  41
    3.2.2 PCR产物回收  41-42
    3.2.3 T载体连接  42
    3.2.4 质粒转化感受态细胞  42
    3.2.5 特异扩增检测  42
    3.2.6 序列分析及新序列提交  42
  3.3 结果与分析  42-48
    3.3.1 梨S_(42)等位基囚的分离与鉴定  42-45
    3.3.2 梨S_(45)等位基因的分离与鉴定  45-48
  3.4 小结与讨论  48-49
4 梨S_(42)-RNase基因的全长基因组序列的分离克隆  49-53
  4.1 材料与方法  49
    4.1.1 试验材料  49
    4.1.2 主要试剂  49
    4.1.3 引物设计  49
  4.2 实验方法  49-50
    4.2.1 S_(42)-RNase基因的PCR扩增  49-50
    4.2.2 PCR产物回收、克隆、转化  50
    4.2.3 特异引物检测  50
  4.3 结果与分析  50-52
    4.3.1 S_(42)-RNase特异扩增分析  50
    4.3.2 测序结果分析  50-52
  4.4 小结与讨论  52-53
5 梨S_(22)和S_(42)全长cDNA序列的分离克隆  53-67
  5.1 试验材料  53-54
    5.1.1 植物材料  53
    5.1.2 主要仪器和试剂  53
    5.1.3 引物的设计及合成  53-54
  5.2 实验方法  54-57
    5.2.1 雌蕊总RNA的提取及检测  54-55
    5.2.2 cDNA第一链的合成  55
    5.2.3 通过3'RACE获得S基因全长cDNA序列  55-57
  5.3 结果与分析  57-66
  5.4 结论与讨论  66-67
6 结论与创新  67-68
  6.1 结论  67
  6.2 创新点  67-68
参考文献  68-74
附录A 提交的序列信息  74-78
附录B 主要试剂配制  78-80
附录C 攻读学位期间发表的学术论文  80-81
致谢  81

15个梨品种S基因型的鉴定及2个梨S基因的全长cDNA克隆

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