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里氏木霉纤维素酶的分离纯化及应用的研究

作　者: 朱年青
导　师: 勇强
学　校: 南京林业大学
专　业: 生物化工
关键词: 纤维素酶分离纯化纤维低聚糖双歧杆菌
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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引　用: 5次
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内容摘要

本文主要研究了里氏木霉(Trichoderma reesei)Rut C30纤维素酶单一组分的分离纯化和酶学性质;纤维素酶单一组分降解纤维素的机理及纤维低聚糖制备技术;在此基础上研究纤维低聚糖对双歧杆菌的增殖作用及双歧杆菌代谢纤维低聚糖的产物组成。主要研究结果如下:通过硫酸铵分级沉淀、HiPrep 26/10 Desalting凝胶过滤脱盐、Source 15 Q阴离子交换,里氏木霉纤维素酶得以初步分开,再经过Source 15 S阳离子交换、HiPrep Sephacryl S-100 HR凝胶过滤、Superdex 75 PrepGrade凝胶过滤进一步分离纯化,得到两个电泳纯内切葡聚糖酶组分EGI、EGII和一个外切葡聚糖酶组分CBHI;经SDS-PAGE电泳测得分子量分别为56.2kDa、52.2kDa和69.0kDa。研究了内切葡聚糖酶EGI、EGII和外切葡聚糖酶CBHI降解纤维素的机理及纤维低聚糖制备技术。内切葡聚糖酶EGI和外切葡聚糖酶CBHI不适合纤维低聚糖的制备。以内切葡聚糖酶EGII酶法制备纤维低聚糖,最佳酶用量1IU/g纤维素,最佳酶解时间90min,制备得到的纤维低聚糖中纤维二糖、纤维三糖和纤维四糖占总糖的比例分别为43.8%、34.8%和7.9%。以葡萄糖、纤维二糖、纤维低聚糖为碳源增殖青春双歧杆菌,葡萄糖对双歧杆菌的增殖效果最好,其次是纤维低聚糖。菌体浓度增殖倍数分别为5.95、2.14和2.84倍。青春双歧杆菌代谢葡萄糖、纤维二糖和纤维低聚糖的主要产物为短链有机酸乳酸、乙酸和丙酸。在三种糖的代谢产物中,含量依次为乳酸、乙酸和丙酸。

全文目录

致谢  3-4
摘要  4-5
ABSTRACT  5-10
1 前言  10-11
2 文献综述  11-22
  2.1 功能性低聚糖  11-14
    2.1.1 纤维低聚糖  11-12
    2.1.2 海藻糖  12-13
    2.1.3 低聚壳聚糖  13
    2.1.4 低聚木糖  13
    2.1.5 大豆低聚糖  13-14
    2.1.6 低聚果糖  14
    2.1.7 低聚异麦芽糖  14
  2.2 功能性低聚糖的制备  14-15
  2.3 纤维素酶及纤维素降解机制  15
  2.4 纤维素酶的分离  15-20
    2.4.1 沉淀法  15-16
    2.4.2 超滤法  16
    2.4.3 离子交换色谱  16-17
    2.4.4 凝胶排阻色谱  17-19
    2.4.5 疏水层析  19
    2.4.6 亲和色谱  19
    2.4.7 电泳技术  19-20
      2.4.7.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳  19-20
      2.4.7.2 等电聚焦电泳  20
  2.5 高活力内切葡聚糖酶的制备  20-21
  2.6 双歧杆菌代谢功能性低聚糖  21-22
    2.6.1 双歧杆菌  21
    2.6.2 功能性低聚糖和双歧杆菌  21-22
3 实验方法与材料  22-32
  3.1 纤维素酶  22
  3.2 纤维素酶的分离纯化  22-23
    3.2.1 硫酸铵沉淀  22
    3.2.2 脱盐和浓缩  22
    3.2.3 Explorer 纯化系统及层析柱  22-23
  3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳  23-24
  3.4 纤维低聚糖的酶法制备  24
  3.5 双歧杆菌的培养  24-25
    3.5.1 菌种  24
    3.5.2 培养基  24-25
    3.5.3 厌氧指示剂的配制  25
    3.5.4 双歧杆菌的活化  25
    3.5.5 双歧杆菌的培养  25
  3.6 分析方法  25-32
    3.6.1 低聚木糖生产废渣水分含量的测定  25-26
    3.6.2 低聚木糖生产废渣纤维素含量的测定  26
    3.6.3 还原糖浓度的测定  26-27
    3.6.4 内切型葡萄聚糖酶（CMC）酶活力测定  27
    3.6.5 外切型葡萄聚糖酶活力测定  27-28
    3.6.6 蛋白质浓度的测定  28
    3.6.7 纤维素酶组分的酶学性质的研究  28-29
      3.6.7.1 纤维素酶组分的最适反应pH 值  28
      3.6.7.2 纤维素酶组分的酸碱稳定性  28
      3.6.7.3 纤维素酶组分的最适反应温度  28-29
      3.6.7.4 纤维素酶组分的热稳定性  29
      3.6.7.5 纤维素酶组分的动力学性质研究  29
    3.6.8 纤维低聚糖的浓度的测定  29-30
    3.6.9 纤维低聚糖组分的分析  30-31
    3.6.10 双歧杆菌菌体浓度的测定  31
    3.6.11 双歧杆菌代谢产物的分析  31-32
4 结果与讨论  32-69
  4.1 纤维素酶的分离纯化  32-42
    4.1.1 纤维素酶粗酶液的硫酸铵沉淀  32-33
    4.1.2 脱盐  33-34
    4.1.3 Source 15Q 阴离子交换层析  34-36
    4.1.4 组分I、II、Ⅲ、Ⅳ的进一步分离纯化  36-38
      4.1.4.1 组分I、II 的Source 15S 阳离子交换层析  36-37
      4.1.4.2 组分Ⅲ的HiPrep Sephacryl S-100 HR 凝胶过滤层析  37-38
      4.1.4.3 组分Ⅳ的Superdex 75 PrepGrade 凝胶过滤层析  38
    4.1.5 EGI、EG II 和CBHI 的分子量的测定  38-39
    4.1.6 分离纯化各步骤及相关参数变化  39-41
    4.1.7 小结  41-42
  4.2 纤维素酶组分的酶学性质及动力学性质研究  42-54
    4.2.1 纤维素酶的最适pH 值及酸碱稳定性  42-46
    4.2.2 纤维素酶的最适温度及热稳定性  46-49
    4.2.3 纤维素酶组分动力学性质的研究  49-53
      4.2.3.1 内切葡聚糖酶EGI、EGII 的Km 值测定  49-52
      4.2.3.2 外切葡聚糖酶CBHI 的Km 值测定  52-53
    4.2.4 小结  53-54
  4.3 纤维低聚糖的制备  54-64
    4.3.1 纤维素酶单一组分降解纤维素的机理  54-57
    4.3.2 EGII、CBHI 酶法制备纤维低聚糖的研究  57-63
      4.3.2.1 EGII 酶解时间对纤维低聚糖组分含量的影响  57-58
      4.3.2.2 EGII 酶用量对纤维低聚糖组分含量的影响  58-60
      4.3.2.3 CBHI 酶解时间对纤维低聚糖组分含量的影响  60-61
      4.3.2.4 CBHI 酶用量对纤维低聚糖组分含量的影响  61-63
    4.3.3 小结  63-64
  4.4 纤维低聚糖对青春双歧杆菌增殖的初步研究  64-69
    4.4.1 双歧杆菌的定量测定  64-65
    4.4.2 葡萄糖、纤维二糖、纤维低聚糖对双歧杆菌的增殖培养  65-66
    4.4.3 青春双歧杆菌代谢产物分析  66-68
    4.4.4 小结  68-69
5 结论  69-71
参考文献  71-75
详细摘要  75-77

里氏木霉纤维素酶的分离纯化及应用的研究

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