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目的脑出血（ICH）是一种常见且致命的卒中类型,在生存者中常常遗留严重神经功能缺损,目前有效治疗方法仍然有限。促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）是一个调节血细胞生成的细胞因子,近来发现EPO及其受体在中枢神经系统中广泛存在,二者结合后具有促进神经生长、神经营养和神经保护作用,但其具体作用机制较复杂,仍然不十分清楚。本研究采用自体血注射方法制备大鼠ICH模型,观察ICH后神经细胞凋亡与Bcl-2、Bax表达的变化,并探讨EPO的干预作用及机制。材料与方法1、动物分组110只Wistar雄性大鼠,体重220～270克,随机分成四组:正常组、假手术组、ICH对照组、rhEPO治疗组,后3组分为6h和12h、24h、48h、72h、120h、168h、7个亚组,每组5只。2、ICH模型的制备参照Xue和Yang的方法,大鼠称重后给予10%水合氯醛腹腔注射麻醉（300mg/kg）,随后俯卧位固定于大鼠脑立体定位仪上,常规备皮消毒,沿头皮正中切开一长约10mm纵切口,切开骨膜,钝性分离暴露前囟,调整立体定位仪,用微型手钻在定位处钻一直径0.5mm的小孔,用微量注射仪取大鼠自体不凝血50ul,注入左侧大鼠尾状核部位,按20ul╱min的速度缓慢匀速注入（3分钟内完成）。注血结束后留针5min,缓慢退针,缝合切口。假手术组除不注血外,其余步骤同上。术后5min治疗组给予rhEPO按3000UI╱Kg（用生理盐水稀释成0.5ml）腹腔注射。模型组及假手术组术后相应时间给予生理盐水0.5ml腹腔注射。正常组大鼠不予手术及给药。3、脑标本采集与组织学检查不同组别大鼠用10%水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉后,剪开胸腔及右心耳,用一钝针经左心室插至主动脉起始部,依次灌注4℃生理盐水300ml,4%多聚甲醛400ml后,断头取脑。用4%多聚甲醛固定24～48h后,以针孔为中心,取厚为3mm的脑组织标本。常规脱水、透明及浸蜡包埋,在切片机上连续切出片厚为5微米的切片,HE染色,光镜观察组织学变化,数码相机照相。4、原位细胞凋亡检测标本切片常规脱蜡至水→新鲜配制3%H2O2室温孵育10min→新鲜稀释ProteinaseK37℃消化10min→加标记液,37℃标记2h→加封闭液室温30min→加生物素化抗地高辛抗体37℃反应30min→加SABC,37℃反应30min→DAB显色→苏木素轻度复染→脱水、封片→显微镜下观察。细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞,即凋亡细胞。每张切片在出血侧皮层计数5个高倍镜视野（×400）,取平均值,为该切片凋亡细胞数。5、Bcl-2、Bax免疫组织化学检测标本切片常规脱蜡至水→3%H2O2室温孵育15min→0.1%TBS中行微波抗原修复10min→正常山羊血清室温孵育20min→滴加兔抗大鼠Bcl-2、Bax多克隆抗体（1:400）→4℃过夜→滴加生物素标记二抗37℃孵育20min→滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素→37℃孵育20min→DAB显色→水洗、复染、封片、光镜下观察。Bcl-2、Bax阳性细胞胞浆/胞膜被染成棕黄色,每张切片在出血侧皮层计数5个高倍镜视野（×400）,取平均值为该切片Bcl-2、Bax阳性细胞数。6、统计学处理采用国际统计软件SPSS13.0处理数据,所有结果用均数±标准差（（?）±s）表示,多样本比较用单因素方差分析;如果差异具有显著性,则进行LSD-t检验,P＜0.05为显著性差异,有统计学意义。Bax蛋白表达与细胞凋亡,Bax/Bcl-2与细胞凋亡,采用Pearson直线相关分析,P＜0.05为显著性差异。结果1、HE染色正常组皮层无坏死细胞,神经元数量多,胞浆丰富,核质细,核仁清楚;假手术组在针道处可见坏死细胞,数目极少。ICH对照组在术后皮层出血中心无神经元,仅见少量胶质细胞,细胞间质空泡样改变;出血边缘区神经元稀疏,细胞间隙增大,细胞缩小,胞膜与周围分界清楚,并可见大量变性及坏死的神经细胞,表现为胞体皱缩,核固缩深染,核仁消失。rhEPO治疗组出血中心区变小,边缘区神经细胞变性坏死减少,多数存活细胞形态相对正常,病变较轻。ICH对照组及rhEPO治疗组术后6h血肿周围皮质可见大量变性及坏死的神经细胞,并持续增多,72h达到高峰,120h变性及坏死的神经细胞下降,各时间点rhEPO治疗组与ICH对照组比较病变减轻。2、脑出血及灶围组织细胞凋亡情况正常组大鼠大脑皮质未见TUNEL阳性细胞,假手术组在针道处大脑皮质有散在TUNEL阳性细胞。ICH对照组及rhEPO治疗组术后6h血肿周围皮质TUNEL阳性细胞已明显增加,并持续增多,72h达到高峰,120h TUNEL阳性细胞数下降,各时间点与假手术组比较差异有极显著性（P＜0.01）。rhEPO治疗组6h～168hTUNEL阳性细胞数明显少于同时点ICH对照组（P＜0.01）。3、各组Bcl-2阳性细胞表达的比较正常组未见Bcl-2阳性细胞,假手术组在针道处大脑皮质可见少量Bcl-2阳性细胞表达。ICH对照组及rhEPO治疗组术后6h血肿周围皮质Bcl-2阳性细胞已明显增加,并持续增多,72h达到高峰,120h Bcl-2阳性细胞数下降,各时间点与假手术组比较差异有极显著性（P＜0.01）。rhEPO治疗组术后6h～168h Bcl-2阳性细胞数较ICH对照组显著增加（P＜0.01）。4、各组Bax阳性细胞表达的比较正常组未见Bax阳性细胞,假手术组在针道处大脑皮质可见少量Bax阳性细胞表达。ICH对照组及rhEPO治疗组术后6h血肿周围皮质Bax阳性细胞已明显增加,并持续增多,72h达到高峰,120h Bax阳性细胞数下降,各时间点与假手术组比较差异有极显著性（均P＜0.01）。rhEPO治疗组术后6h～168h Bax阳性细胞数较ICH对照组显著减少（P＜0.01）。5、经Pearson直线相关分析Bax蛋白表达与细胞凋亡呈正相关（r=0.889,P＜0.01）,Bax/Bcl-2与细胞凋亡呈正相关（r=0.423,P＜0.01）。结论凋亡机制参与了脑出血后继发性损伤的过程,促红细胞生成素可能通过上调Bcl-2蛋白表达,下调Bax蛋白表达,对脑出血后神经损伤起保护作用。
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