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奶牛布鲁氏菌的PCR检测与分子分型研究

作　者: 杜振昆
导　师: 简子健；周继勇
学　校: 新疆农业大学
专　业: 临床病理
关键词: 布鲁氏菌 分离鉴定 牛奶 PCR 分子分型
分类号: S854.43
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


为了调查奶牛布鲁氏菌病的流行和发病情况,本研究利用虎红平板凝集试验(RBT)和试管凝集试验(SAT)对浙江省奶牛养殖较为集中的金华地区30个奶牛场28243头奶牛进行布鲁氏菌病原普查,结果阳性牛1880头,阳性率为6.66%。采集布鲁氏菌阳性的奶牛奶样570份,通过使用选择性培养基将奶样中的细菌进行分离培养,分离纯化细菌62株。将纯化出的细菌进行革兰氏染色、柯兹罗夫斯基鉴别染色和生化试验,50株分离菌株符合布鲁氏菌生化指标特征。为了建立从奶品中监控布鲁氏菌感染的方法,本研究根据GenBank公布的牛布鲁氏菌基因序列设计内、外向引物,优化牛奶样品中布鲁氏菌基因组DNA提取方法,建立了牛奶布鲁氏菌套式PCR方法。结果显示,使用人工合成的两对布鲁氏菌16S rRNA套式引物,通过两次扩增,可有效扩增出牛奶中污染布鲁氏菌的16S rRNA的特异性DNA片段,其对牛奶样品中布鲁氏菌检测下限达3.3 CFU/ml,与细菌分离鉴定方法的吻合率为100%,与大肠杆菌、溶血性链球菌、沙门氏菌、克雷伯氏杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和螺旋杆菌之间不存在交叉反应。这些结果显示,本试验建立的布鲁氏菌套式PCR检测方法具有高度的特异性和敏感性,适用于布鲁氏菌的实验室快速检测。对奶牛布鲁氏菌的分子分型进行探索。根据编码布鲁氏菌36kDa外膜蛋白的omp2基因多态性设计引物,利用PCR扩增和DNA测序,测序结果在NCBI上软件BLAST序列比对分析,51株菌中43株为B.abortus,8株为B. millitensis;利用布鲁氏菌omp2多态性只能分出布鲁氏菌的种,而不能区分具体种的生物型。转座因子IS711在不同种布鲁氏菌中存在插入位置的多态性,具有种属特异性,设计IS711通用特异性引物和B.abortus、B.melitensis、B.ovis、B.suis四个特异下游配对引物,以及可以扩增B.abortus5、6、9和3b型的引物DEL569构成AMOS-PCR,对51株布鲁氏菌进行检测,结果鉴定B.abortus5、6、9或3b型35株,B.abortus1、2或4型2株,B.melitensis5株,另有9株不能鉴定生物型。B. melitensis 16M rpoB基因编码,全长4134 bp,在各个种和生物型中均具有的多态性,通过对上述未分型9株细菌rpoB基因的克隆和序列分析,鉴定3株B. melitensis 1型,1株B. abortus 1或4型,1株B. abortus 7型,其余4株有待进一步鉴定。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-10
第一部分 文献综述  10-25
  1 布鲁氏菌的病原生物学  11-14
    1.1 布鲁氏菌的种型特性  11
    1.2 布鲁氏菌的抗原结构  11-12
    1.3 毒力  12
    1.4 布鲁氏菌的变异  12-13
    1.5 布鲁氏菌抵抗力和致病力  13
    1.6 流行病学  13-14
  2 布鲁氏菌的分子生物学  14-18
    2.1 DNA 同源性分析  14-15
    2.2 布鲁氏菌主要外膜蛋白  15-16
    2.3 布鲁氏菌 DNA 的多态性研究  16-18
    2.4 DNA 限制性内切酶图谱分析  18
  3 分类研究  18-19
  4 诊断研究  19-24
    4.1 血清学检测  19-21
    4.2 PCR 检测  21-23
    4.3 核酸探针检测  23-24
  5 布病研究的突破方向  24-25
第二部分 研究内容  25-63
  第一章 金华地区奶牛布鲁氏菌的分离鉴定  25-37
    1 材料与方法  25-29
      1.1 试剂  25
      1.2 奶牛布鲁氏菌普检  25-26
      1.3 病料采集与筛选  26-27
      1.4 分离培养  27-28
      1.5 染色鉴定  28
      1.6 生化试验  28-29
    2 结果  29-35
      2.1 奶牛布鲁氏菌普检  29
      2.2 病料采集  29
      2.3 细菌分离培养  29-31
      2.4 染色鉴定  31-32
      2.5 生化试验  32-35
    3 讨论  35-37
  第二章 奶样中布鲁氏菌套式PCR 检测方法的建立  37-48
    1 材料与方法  38-42
      1.1 菌株和奶样  38
      1.2 试剂  38
      1.3 细菌培养  38
      1.4 用 PCR 方法鉴定可疑菌株  38-40
      1.5 牛奶样品中布鲁氏菌套式 PCR 检测方法的建立  40-42
    2 结果  42-46
      2.1 引物筛选与 PCR 反应体系建立  42
      2.2 细菌 DNA 的提取  42-43
      2.3 套式 PCR 引物的特异性  43-44
      2.4 可疑菌株的 PCR 鉴定  44-45
      2.5 套式 PCR 扩增的敏感性  45-46
      2.6 临床牛奶样品的套式 PCR 检测  46
    3 讨论  46-48
  第三章 布鲁氏菌分子分型初步研究  48-63
    1 材料和方法  49-55
      1.1 菌株  49
      1.2 引物设计  49-50
      1.3 染色体 DNA 的提取  50
      1.4 PCR 扩增  50-53
      1.5 PCR 产物纯化  53
      1.6 连接  53-54
      1.7 大肠杆菌感受态细胞制备(CaC12法)  54
      1.8 转化  54
      1.9 重组菌鉴定  54
      1.10 序列测定  54-55
      1.11 序列分析  55
    2 结果  55-60
      2.1 omp2 基因分型  55-59
      2.2 AMOS-PCR 的分型  59-60
      2.3 rpoB 基因分型  60
    3 讨论  60-63
结论  63-64
参考文献  64-71
附录 A 溶液与试剂配方  71-74
致谢  74-75
作者简历  75

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医临床医学 > 兽医诊断学 > 实验室诊断法
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